הבדל מפתח - Sanger Sequencing לעומת Pyrosequencing
ריצוף DNA חשוב מאוד לניתוח DNA מאחר שידע על סידור הנוקלאוטידים הנכון באזור DNA מסוים חושף מידע חשוב רב עליו. ישנן שיטות שונות לריצוף DNA. רצף Sanger ו- Pyrosequencing הן שתי שיטות רצף DNA שונות בשימוש נרחב בביולוגיה מולקולרית. ההבדל העיקרי בין רצף Sanger ל- Pyrosequencing הוא שרצף Sanger משתמש ב-dideoxynucleotides כדי להפסיק את הסינתזה של ה-DNA כדי לקרוא את רצף הנוקלאוטידים בעוד ש-pyrosequencing מזהה את שחרור הפירופוספטים על ידי שילוב הנוקלאוטידים וסינתזה של הרצף המדויק של הרצף המשלים.
מה זה Sanger Sequencing?
סנג'ר רצף היא שיטת רצף DNA מהדור הראשון שפותחה על ידי פרדריק סנגר והמכללות שלו בשנת 1977. היא ידועה גם בשם Chain Termination Sequencing או Dideoxy sequencing שכן היא מבוססת על סיום שרשרת על ידי dideoxynucleotides (ddNTPs). שיטה זו הייתה בשימוש נרחב במשך יותר מ-30 שנה עד שפותח ה-New Generation Sequencing (NGS). טכניקת רצף סנגר אפשרה את גילוי סדר הנוקלאוטידים הנכון או הצמדת קטע DNA מסוים. הוא מבוסס על שילוב סלקטיבי של ddNTPs והפסקת סינתזת ה-DNA במהלך שכפול ה-DNA במבחנה. היעדר קבוצות OH 3' להמשך יצירת קשר פוספודיסטר בין נוקלאוטידים סמוכים הוא תכונה ייחודית של ddNTPs. מכאן שברגע שה-ddNTP מחובר, התארכות השרשרת נפסקת ומסתיימת מאותה נקודה. ישנם ארבעה ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP ו-ddTTP - בשימוש ברצף Sanger. נוקלאוטידים אלה עוצרים את תהליך שכפול ה-DNA כאשר הם משולבים בגדיל ה-DNA הגדל וגורמים לאורכים משתנים של DNA קצר.אלקטרופורזה של ג'ל נימי משמשת לארגון גדילי DNA קצרים אלה לפי גודלם על ג'ל כפי שמוצג באיור 01.
איור 1: אלקטרופורזה של ג'ל נימי של DNA קצר מסונתז
לשכפול חוץ-גופני של DNA, יש לספק כמה דרישות. הם אנזים DNA פולימראז, DNA תבנית, פריימרים של אוליגונוקלאוטידים ודאוקסינוקלאוטידים (dNTPs). ברצף Sanger, שכפול DNA מתבצע בארבע מבחנות נפרדות יחד עם ארבעה סוגים של ddNTPs בנפרד. Deoxynucleotides אינם מוחלפים לחלוטין על ידי ddNTPs המתאימים. תערובת של ה-dNTP המסוים (לדוגמה; dATP + ddATP) כלולה בצינור ומשוכפלים. ארבעה מוצרי שפופרת נפרדים מופעלים על ג'ל בארבע בארות נפרדות. לאחר מכן על ידי קריאת הג'ל, ניתן לבנות את הרצף כפי שמוצג באיור 02.
איור 02: Sanger Sequencing
ריצוף Sanger הוא טכניקה חשובה המסייעת בתחומים רבים בביולוגיה מולקולרית. פרויקט הגנום האנושי הושלם בהצלחה בעזרת שיטות המבוססות על רצף Sanger. רצף Sanger שימושי גם בריצוף DNA מטרה, מחקר סרטן ומחלות גנטיות, ניתוח ביטוי גנים, זיהוי אנושי, זיהוי פתוגנים, רצף מיקרוביאלי וכו'.
יש כמה חסרונות של רצף Sanger:
- אורך ה-DNA שרצף לא יכול להיות יותר מ-1000 זוגות בסיסים
- ניתן לרצף רק גדיל אחד בכל פעם.
- התהליך גוזל זמן ויקר.
לכן, טכניקות רצף מתקדמות חדשות פותחו עם הזמן כדי להתגבר על בעיות אלו. עם זאת, רצף Sanger עדיין בשימוש בשל התוצאות המדויקות ביותר שלו עד כ-850 שברי אורך זוגות בסיסים.
מה זה Pyrosequencing?
Pyrosequencing היא טכניקת ריצוף DNA חדשה המבוססת על "רצף על ידי סינתזה". טכניקה זו מסתמכת על זיהוי שחרור פירופוספט לאחר שילוב הנוקלאוטיד. התהליך מופעל על ידי ארבעה אנזימים שונים: DNA פולימר, ATP sulfurylase, לוציפראז ואפיראז ושני מצעים אדנוזין 5' פוספוסולפט (APS) ולוציפרין.
התהליך מתחיל בקישור הפריימר לתבנית ה-DNA החד-גדילית ו-DNA פולימראז מתחיל את השילוב של נוקלאוטידים משלימים לו. כאשר הנוקלאוטידים מתחברים יחד (פילמור חומצת גרעין), הוא משחרר פירופוספט (שתי קבוצות פוספט הקשורות יחדיו) קבוצות ואנרגיה.כל תוספת נוקלאוטיד משחררת כמות שווה-מולרית של פירופוספט. Pyrophosphate הופך ל-ATP על ידי ATP sulfurylase בנוכחות מצע APS. ה-ATP שנוצר מניע את ההמרה בתיווך לוציפראז של לוציפרין לאוקסילוציפרין, ומייצר אור נראה בכמויות פרופורציונליות לכמות ה-ATP. האור מזוהה על ידי מכשיר זיהוי פוטון או על ידי מכפיל פוטו ויוצר פירוגרמה. Apyrase מפרק ATP ו-dNTPs שאינם משולבים בתערובת התגובה. הוספת dNTP מתבצעת פעם אחת. מכיוון שהוספת נוקלאוטיד ידועה על פי שילוב וזיהוי של אור, ניתן לקבוע את רצף התבנית. פירוגרמה משמשת ליצירת רצף הנוקלאוטידים של ה-DNA המדגם כפי שמוצג באיור 03.
Pyrosequencing חשוב מאוד בניתוח פולימורפיזם נוקלאוטיד בודד וברצף של קטעים קצרים של DNA. הדיוק הגבוה, הגמישות, קלות האוטומציה והעיבוד המקביל הם היתרונות של רצף פירוז על פני טכניקות רצף Sanger.
איור 03: Pyrosequencing
מה ההבדל בין Sanger Sequencing ל-Pyrosequencing?
Sanger Sequencing לעומת Pyrosequencing |
|
| ריצוף Sanger היא שיטת ריצוף DNA המבוססת על שילוב סלקטיבי של ddNTPs על ידי DNA פולימראז וסיום שרשרת. | Pyrosequencing היא שיטת ריצוף DNA המבוססת על זיהוי של שחרור פירופוספט לאחר שילוב של נוקלאוטיד. |
| שימוש ב-ddNTP | |
| ddNTPs משמשים להפסקת שכפול ה-DNA | לא נעשה שימוש ב-ddNTP. |
| אנזימים מעורבים | |
| DNA פולימראז משמשים. | משתמשים בארבעה אנזימים: DNA פולימראז, ATP sulfurylase, Luciferase ו-Apyrase. |
| אמצעים בשימוש | |
| APS ולוציפרין אינם בשימוש. | Adenosine 5' phosphosulfate (APS) ולוציפרין משמשים. |
| טמפרטורה מקסימלית | |
| זה תהליך איטי. | זהו תהליך מהיר. |
סיכום – Sanger Sequencing לעומת Pyrosequencing
ריצוף Sanger ו-Pyrosequencing הן שתי שיטות רצף DNA המשמשות בביולוגיה מולקולרית. רצף סנגר בונה את סדר הנוקלאוטידים ברצף על ידי סיום התארכות השרשרת בעוד שהפירוזיקנס בונה את הסדר המדויק של הנוקלאוטידים ברצף על ידי שילוב של נוקלאוטידים וזיהוי שחרור פירופוספטים.לכן, ההבדל העיקרי בין רצף Sanger ל-Pyrosequencing הוא ש-Sanger רצף עובד על רצף על ידי סיום שרשרת בעוד pyrosequencing עובד על רצף על ידי סינתזה.
