הבדל מפתח - Microarray לעומת RNA Sequencing
Transcriptome מייצג את כל התוכן של RNA הקיים בתא כולל mRNA, rRNA, tRNA, RNA מושפל ו-RNA לא מושפל. יצירת פרופילים של תעתיק הוא תהליך חשוב על מנת להבין את תובנות התא. ישנן מספר שיטות מתקדמות ליצירת פרופיל תעתיק. רצף מיקרו-מערך ו-RNA הם שני סוגים של טכנולוגיות שפותחו לניתוח תעתיק. ההבדל העיקרי בין רצף מיקרו-מערך ל-RNA הוא ש-micro-array מבוסס על פוטנציאל ההכלאה של בדיקות מתוכננות מראש עם רצפי cDNA מטרה בעוד רצף RNA מבוסס על רצף ישיר של גדילי cDNA על ידי טכניקות רצף מתקדמות כגון NGS.מיקרו-מערך מתבצע עם הידע המוקדם על הרצפים ורצף RNA מתבצע ללא הידע המוקדם על רצפים.
מה זה Microarray?
Microarray היא שיטה חזקה, אמינה ותפוקה גבוהה המשמשת ליצירת פרופיל תעתיק על ידי מדענים. זוהי הגישה הפופולרית ביותר לניתוח תמלול. זוהי שיטה בעלות נמוכה, שתלויה בבדיקות ההכלאה.
הטכניקה מתחילה עם מיצוי של mRNA מהדגימה ובניית ספריית cDNA מ-RNA הכולל. לאחר מכן הוא מעורבב עם בדיקות מתוכננות מראש עם תיוג ניאון על משטח מוצק (מטריקס נקודתי). רצפים משלימים כלאיים עם הבדיקות המסומנות במיקרו-מערך. ואז microarray נשטף ומסונן, והתמונה נכמת. יש לנתח נתונים שנאספו כדי לקבל את פרופילי הביטוי היחסיים.
ההנחה היא שהעוצמה של בדיקות המיקרו-מערך היא פרופורציונלית לכמות התמלילים במדגם.עם זאת, הדיוק של הטכניקה תלוי בבדיקות המתוכננות, בידע מוקדם של הרצף ובזיקה של בדיקות להכלאה. מכאן שלטכנולוגיית microarray יש מגבלות. לא ניתן לבצע טכניקת Microarray עם תמלילים בשפע נמוך. הוא לא מצליח להבדיל בין איזופורמים ולזהות גרסאות גנטיות. מכיוון ששיטה זו תלויה בהכלאה של בדיקות, כמה בעיות הקשורות להכלאה כגון הכלאה צולבת, הכלאה לא ספציפית וכו' מתרחשות בטכניקת מיקרו-מערכים.
איור 01: Microarray
מהו רצף RNA?
רצף רובה ציד של RNA (RNA seq) היא טכניקת רצף שלם של תעתיקים שפותחה לאחרונה. זוהי שיטת תפוקה מהירה וגבוהה של פרופיל תעתיק. זה מכמת ישירות את הביטוי של גנים ומביא לחקירה עמוקה של התעתיק. RNA seq אינו תלוי בבדיקות שתוכננו מראש או בידע מוקדם של הרצפים. לכן, לשיטת RNA seq יש רגישות גבוהה ויכולת לזהות גנים חדשים וגרסאות גנטיות.
שיטת רצף RNA מבוצעת באמצעות מספר שלבים. ה-RNA הכולל של התא חייב להיות מבודד ומפוצל. לאחר מכן, באמצעות transcriptase הפוכה, יש להכין ספריית cDNA. כל גדיל cDNA חייב להיות קשור עם מתאמים. לאחר מכן יש להגביר ולטהר את השברים הקשורים. לבסוף באמצעות שיטת NGS, יש לבצע רצף של ה-cDNA.
איור 02: רצף RNA
מה ההבדל בין רצף Microarray ו-RNA?
Microarray vs RNA Sequencing |
|
| Microarray היא שיטת תפוקה חזקה, אמינה ובעלת תפוקה גבוהה. | ריצוף RNA הוא שיטה מדויקת ובעלת תפוקה גבוהה. |
| עלות | |
| זוהי שיטה בעלות נמוכה. | זו שיטה יקרה. |
| ניתוח של מספר רב של דגימות | |
| זה מקל על ניתוח מספר רב של דגימות בו-זמנית. | זה מקל על ניתוח מספר רב של דגימות. |
| ניתוח נתונים | |
| ניתוח הנתונים מורכב. | נתונים נוספים נוצרים בשיטה זו; לפיכך, התהליך מורכב יותר. |
| ידע קודם ברצפים | |
| שיטה זו מבוססת על בדיקות הכלאה, לכן ידע מוקדם ברצפים נדרש. | שיטה זו אינה תלויה בידע הקודם ברצף. |
| ווריאציות מבניות וגנים חדשים | |
| שיטה זו אינה יכולה לזהות וריאציות מבניות וגנים חדשים. | שיטה זו יכולה לזהות וריאציות מבניות כגון מיזוג גנים, שחבור חלופי וגנים חדשים. |
| רגישות | |
| זה לא יכול לזהות הבדלים בביטוי של איזופורמים, ולכן יש לזה רגישות מוגבלת. | לזה יש רגישות גבוהה. |
| תוצאה | |
| זה יכול לגרום רק לרמות ביטוי יחסיות. זה לא נותן כימות מוחלט של ביטוי גנים. | זה נותן רמות ביטוי מוחלטות ויחסיות. |
| ניתוח מחדש של נתונים | |
| יש להפעיל את זה מחדש כדי לנתח מחדש. | ניתן לנתח מחדש נתוני רצף. |
| צורך בכוח אדם ותשתית ספציפיים | |
| אין צורך בתשתית וכוח אדם ספציפיים עבור מיקרו-מערך. | תשתית וכוח אדם ספציפיים הנדרשים על ידי רצף RNA. |
| בעיות טכניות | |
| טכניקת Microarray כוללת בעיות טכניות כמו הכלאה צולבת, הכלאה לא ספציפית, קצב זיהוי מוגבל של בדיקות בודדות וכו'. | טכניקת RNA seq מונעת בעיות טכניות כמו הכלאה צולבת, הכלאה לא ספציפית, קצב זיהוי מוגבל של בדיקות בודדות וכו'. |
| Biases | |
| זוהי שיטה מוטה מכיוון שהיא תלויה בהכלאה. | הטיה נמוכה בהשוואה למיקרו-מערך. |
סיכום – Microarray vs RNA Sequencing
שיטות ריצוף מיקרו-מערך ו-RNA הן פלטפורמות עם תפוקה גבוהה שפותחו עבור פרופיל תעתיק. שתי השיטות מייצרות תוצאות המתואמות מאוד לפרופילי ביטוי גנים. עם זאת, לרצף RNA יש יתרונות על פני מיקרו-מערך לניתוח ביטוי גנים. רצף RNA הוא שיטה רגישה יותר לזיהוי תמלילים בשפע נמוך מאשר מיקרו-מערך. רצף RNA מאפשר גם את ההבחנה בין איזופורמים וזיהוי של וריאנטים של גנים. עם זאת, מיקרו-מערך הוא הבחירה הנפוצה של רוב החוקרים מכיוון שרצף RNA הוא טכניקה חדשה ויקרה עם אתגרי אחסון נתונים וניתוח נתונים מורכב.
