הבדל מפתח - מקסאם גילברט נגד סאנג'ר רצף
נוקלאוטידים הם היחידות המבניות הבסיסיות ואבני הבניין של ה-DNA. מולקולת DNA מורכבת משרשרת פולינוקלאוטידים. ישנם ארבעה נוקלאוטידים שונים שנמצאים ב-DNA. נוקלאוטידים אלו מורכבים מארבעה בסיסים חנקניים שונים בשם A (אדנין), G (גואנין), C (ציטוזין), T (תימין). לסדר הנוקלאוטידים במולקולת ה-DNA יש חשיבות רבה שכן הוא מקודד מידע גנטי חשוב לצמיחה והתפתחות של אורגניזמים. רצף DNA מתייחס לתהליך הקובע את רצף הנוקלאוטידים המדויק של ה-DNA. ישנן שיטות שונות לריצוף DNA.רצף מקסאם גילברט וריצוף DNA של סנגר הן שתי שיטות של רצף DNA השייכות לרצף הדור הראשון. הליך הרצף של Maxam Gilbert קובע את רצף הבסיס על ידי ביקוע כימי של קטעי ה-DNA המסומנים בקצה 5', באופן מועדף בכל אחד מארבעה נוקלאוטידים ואלקטרופורזה של ג'ל. הליך רצף Sanger קובע את רצף הנוקלאוטידים על ידי סינתזה של DNA חד-גדילי באמצעות DNA פולימראז ודידיאוקסינוקלאוטידים ואלקטרופורזה של ג'ל. זה ההבדל העיקרי בין Maxam Gilbert ל-Sanger Sequencing.
מהו Maxam Gilbert Sequencing?
רצף Maxam Gilbert, הידוע גם כשיטת רצף כימי, היא טכניקה שפותחה כדי לקבוע את סדר הנוקלאוטידים ב-DNA. שיטה זו הוצגה על ידי וולטר גילברט ואלן מקסאם בשנת 1976 והפכה לפופולרית מכיוון שניתן לבצע אותה ישירות עם DNA מטוהר. שיטת Maxam Gilbert שייכת לדור הראשון של ריצוף DNA, וזו הייתה שיטת הריצוף הראשונה בשימוש נרחב על ידי מדענים.
העיקרון הבסיסי של שיטה זו טמון בהגבלה של שברי ה-DNA המסומנים בסוף בבסיסים ספציפיים על ידי כימיקלים ותנאים ספציפיים לבסיס והפרדה של השברים המסומנים על ידי אלקטרופורזה כפי שמוצג באיור 01. השברים מופרדים בהתאם לגדלים שלהם על הג'ל. מכיוון שהשברים מסומנים, ניתן להסיק בקלות את הרצף של מולקולת ה-DNA.
שיטת Maxam Gilbert משתמשת בכימיקלים ספציפיים לבסיס כדי לשבור DNA בבסיסים ספציפיים. שני כימיקלים נפוצים בשם דימתיל סולפט וכימיקלים הידרזין משמשים לתקיפה סלקטיבית של פורינים ופירמידינים, בהתאמה.
שיטת הרצף של Maxam Gilbert מתבצעת באמצעות מספר שלבים כדלקמן.
- טיהור רצף ה-DNA באמצעות אנדונוקלאזות של הגבלה
- תיוג של קצוות שברי ה-DNA על ידי הוספת פוספטים רדיואקטיביים
- טיהור השברים המסומנים משברים שאינם מסומנים באמצעות אלקטרופורזה ג'ל
- הפרדת ה-DNA המסומן בסוף לארבע צינורות וטיפול בנפרד עם כימיקלים ספציפיים לבסיס
- אלקטרופורזה של תכולת כל צינור בקווים נפרדים על גבי ג'ל והפרדת שברים לפי אורכם.
- זיהוי השברים באמצעות אוטורדיוגרף.
איור 01: Maxam Gilbert Sequencing
מה זה Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing היא שיטת רצף שפותחה על ידי פרדריק סנגר ועמיתיו ב-1977 כדי לקבוע את רצף הבסיס של שבר DNA נתון. זה ידוע גם כרצף סיום שרשרת או שיטת רצף דידיאוקסי. שיטה זו פועלת על העיקרון של שילוב סלקטיבי של דידיאוקסינוקלאוטידים מסיימים שרשרת (ddNTPs) כגון ddGTP, ddCTP, ddATP ו-ddTTP על ידי DNA פולימראז במהלך סינתזה של DNA גדילי יחיד כדי להפסיק את היווצרות הגדיל.ל-Dideoxynucleotides חסרות קבוצות OH 3' ליצירת קשרים פוספודיסטרים עם נוקלאוטיד סמוך. לפיכך, היווצרות הגדיל נעצרת ברגע ש-ddNTP משולב בגדיל החדש שנוצר במהלך רצף סנגר.
בשיטה זו, ארבע תגובות סינתזת DNA נפרדות (PCR) מבוצעות בארבעה צינורות נפרדים עם סוג אחד של ddNTP. דרישות אחרות מסופקות גם עבור הצינורות ל-PCR כולל פריימרים, dNTPs, Taq פולימראז, תנאים ספציפיים וכו'. ארבע תגובות נפרדות מבוצעות בארבע צינורות עם ארבע תערובות. לאחר תגובות PCR, שברי DNA שנוצרו עוברים דנטורציה בחום ומופרדים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל. לאחר מכן השברים מומחשים באמצעות פריימר מסומן (רדיואקטיבי או ניאון) או dNTPs כפי שמוצג באיור 02.
איור 02: Sanger Sequencing
מה ההבדל בין Maxam Gilbert ל-Sanger Sequencing?
מקסם גילברט נגד סנגר רצף |
|
| ריצוף של מקסימום גילברט היא הטכניקה הראשונה שפותחה לרצף DNA. | שיטת רצף Sanger הוצגה לאחר שיטת הרצף של Maxam Gilbert. |
| שימוש | |
| שיטה זו משמשת לעתים רחוקות. | רצף Sanger משמש באופן שגרתי לרצף. |
| שימוש בכימיקלים מסוכנים | |
| הוא משתמש בכימיקלים מסוכנים. | השימוש בכימיקלים מסוכנים מוגבל בהשוואה לשיטת Maxam Gilbert. |
| תיוג לזיהוי | |
| שיטה זו משתמשת ב-P32 רדיואקטיבית לתיוג הקצוות של שברי ה-DNA. | ריצוף Sanger משתמש ב-ddNTP עם תיוג רדיואקטיבי או פלואורסצנטי. |
סיכום – מקסאם גילברט נגד סאנג'ר רצף
רצף מקסאם גילברט וסנג'ר הם שני סוגים של טכניקות רצף DNA המגיעות תחת רצף DNA מהדור הראשון. רצף Maxam Gilbert היא השיטה הראשונה שהוצגה לרצף DNA בשנת 1976, והיא מבוצעת על ידי שבירת שברי ה-DNA המסומנים בקצה על ידי כימיקלים ספציפיים לבסיס. לפיכך, זה ידוע בתור רצף כימי. שיטת רצף Sanger הוצגה בשנת 1977, והיא מבוססת על תגובות סיום השרשרת המונעות על ידי ddNTP. שיטת רצף Sanger פופולרית משיטת Maxam Gilbert עקב מספר חסרונות של שיטת Maxam Gilbert כמו צריכת זמן מופרזת, שימוש בכימיקלים מסוכנים וכו'.זה ההבדל בין רצף מקסאם גילברט ל-Sanger.
