הבדל מפתח – רצף NGS לעומת Sanger
Next Generation Sequencing (NGS) ו-Sanger Sequencing הם שני סוגים של טכניקות רצף נוקלאוטידים שפותחו במהלך הזמן. שיטת Sanger Sequencing הייתה בשימוש נרחב במשך שנים רבות ו-NGS החליפה אותה לאחרונה בשל יתרונותיה. ההבדל העיקרי בין NGS ל-Sanger Sequencing הוא ש-NGS פועל על העיקרון של רצף מיליוני רצפים בו-זמנית בצורה מהירה דרך מערכת רצף בעוד ש-Sanger Sequencing פועל על עיקרון סיום השרשרת עקב שילוב סלקטיבי של dideoxynucleotides על ידי אנזים DNA פולימראז במהלך שכפול ה-DNA והפרדת הפרגמנטים כתוצאה מכך על ידי אלקטרופורזה נימית.
מהו רצף נוקלאוטידים?
מידע גנטי מאוחסן ברצפי הנוקלאוטידים של ה-DNA או ה-RNA של אורגניזם. תהליך קביעת הסדר הנכון של נוקלאוטידים (באמצעות ארבעה בסיסים) במקטע נתון (בגן, אשכול גנים, כרומוזום וגנום שלם) ידוע כרצף נוקלאוטידים. חשוב מאוד במחקרים גנומיים, מחקרים משפטיים, וירולוגיה, שיטתיות ביולוגית, אבחון רפואי, ביוטכנולוגיה ובתחומים רבים נוספים לנתח את המבנה והתפקוד של גנים. ישנם סוגים שונים של שיטות רצף שפותחו על ידי מדענים. ביניהם, רצף Sanger שפותח על ידי פרדריק סנגר ב-1977 היה בשימוש נרחב וזכה לפופולריות במשך תקופה ארוכה עד ש- Next Generation Sequencing החליף אותו.
מה זה NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) הוא מונח המשמש להתייחסות לתהליכי רצף מודרניים בתפוקה גבוהה. הוא מתאר מספר טכנולוגיות רצף מודרניות שונות אשר חוללו מהפכה במחקרים הגנומיים ובביולוגיה מולקולרית.טכניקות אלו הן רצף Illumina, רצף Roche 454, רצף Ion Proton ו-SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection). מערכות NGS מהירות וזולות יותר. ארבע שיטות רצף DNA עיקריות משמשות במערכות NGS, כלומר; pyrosequencing, רצף על ידי סינתזה, רצף על ידי קשירה ורצף מוליכים למחצה יונים. מספר רב של גדילי DNA או RNA (מיליוני) ניתנים לרצף במקביל. זה מאפשר רצף של כל הגנום של אורגניזמים בתוך פרק זמן קצר, בניגוד לרצף Sanger שלוקח יותר זמן.
NGS יש יתרונות רבים על פני שיטת Sanger לרצף קונבנציונלי. זהו תהליך מהיר, מדויק וחסכוני יותר שניתן לבצע עם גודל מדגם קטן. ניתן להשתמש ב-NGS במחקרים מטגנומיים, בזיהוי וריאציות בתוך גנום בודד עקב כניסות ומחיקות וכו' ובניתוח של ביטויי גנים.
Figure_1: התפתחויות ב-NGS Sequencing
מה זה Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing היא שיטת ריצוף שפותחה על ידי פרדריק סנגר ועמיתיו ב-1977 כדי לקבוע את סדר הנוקלאוטידים המדויק של קטע DNA נתון. זה ידוע גם בשם רצף סיום שרשרת או רצף דידיאוקסי. עקרון העבודה של שיטה זו הוא הפסקת סינתזת גדילים על ידי שילוב סלקטיבי של שרשרת מסיימת דידיאוקסינוקלאוטידים (ddNTPs) כגון ddGTP, ddCTP, ddATP ו-ddTTP על ידי DNA פולימראז במהלך שכפול ה-DNA. לנוקלאוטידים רגילים יש קבוצות OH 3' ליצירת קשר פוספודיסטר בין נוקלאוטידים סמוכים להמשך יצירת הגדיל. עם זאת, ל-ddNTPs חסר קבוצת OH 3' ואינם מסוגלים ליצור קשרים פוספודיסטרים בין נוקלאוטידים. לפיכך, התארכות השרשרת הופסקה.
בשיטה זו, ה-DNA החד-גדילי שיש לרצף משמש כגדיל התבנית לסינתזת DNA במבחנה.דרישות נוספות הן פריימר של אוליגונוקלאוטידים, מבשרי דאוקסינוקלאוטידים ואנזים DNA פולימראז. כאשר הקצוות האגפים של קטע המטרה ידועים, ניתן לעצב בקלות פריימרים לשכפול DNA. ארבע תגובות סינתזת DNA נפרדות מבוצעות בארבעה צינורות נפרדים. לכל צינור יש ddNTPs נפרדים, יחד עם דרישות אחרות. מהנוקלאוטיד המסוים, מוסיפים תערובת של dNTPs ו-ddNTPs. באופן דומה, ארבע תגובות נפרדות מבוצעות בארבעה צינורות עם ארבע תערובות. לאחר התגובות, מתבצע זיהוי של שברי DNA והמרה של תבנית הפרגמנט למידע על רצף. שברי DNA שנוצרו עוברים דנטורציה בחום ומופרדים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל. אם משתמשים בנוקלאוטידים רדיואקטיביים, ניתן להמחיש את דפוס הרצועות בג'ל הפוליקרילאמיד על ידי אוטורדיוגרפיה. כאשר שיטה זו משתמשת ב-dideoxynucleotides מתויגים פלואורסצנטיים, ניתן להפחית אותה במורד הג'ל לקרוא ולהעביר אותה דרך קרן לייזר שתתגלה על ידי גלאי הפלורסנט.כדי למנוע שגיאות שעלולות להתעורר כאשר רצף נקרא בעין ונכנס ידנית למחשב, שיטה זו התפתחה לשימוש ברצף אוטומטי בשילוב עם המחשב.
זו השיטה המשמשת לרצף DNA מפרויקט הגנום האנושי. שיטה זו עדיין בשימוש עם שינויים מתקדמים מכיוון שהיא נותנת מידע רצף מדויק למרות היותה תהליך יקר ואיטי.
Figure_2: Sanger Sequencing
מה ההבדל בין NGS ל-Sanger Sequencing?
NGS נגד Sanger Sequencing |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) מתייחס לתהליכי רצף מודרניים בתפוקה גבוהה. הוא מתאר מספר טכנולוגיות רצף מודרניות שונות | Sanger Sequencing היא שיטת רצף שפותחה על ידי פרדריק סנגר כדי לקבוע את סדר הנוקלאוטידים המדויק של קטע DNA נתון. |
| עלות תועלת | |
| NGS הוא תהליך זול יותר מכיוון שהוא מפחית זמן, כוח אדם וכימיקלים. | זהו תהליך יקר מכיוון שהוא דורש זמן, כוח אדם ועוד כימיקלים. |
| Speed | |
| זה מהיר יותר מכיוון שגם זיהוי כימי וגם זיהוי אותות של גדילים רבים מתרחשים במקביל. | זה גוזל זמן מכיוון שזיהוי כימי וזיהוי אותות מתרחשים כשני תהליכים נפרדים ורק על גדיל יכול לקרוא בכל פעם. |
| Reliability | |
| NGS הוא אמין. | רצף Sanger פחות אמין |
| גודל לדוגמה | |
| NGS דורש פחות כמות של DNA. | שיטה זו זקוקה לכמות גדולה של תבנית DNA. |
| בסיסי DNA לכל קטע ברצף | |
| מספר בסיסי ה-DNA לכל קטע רצף נמוך משיטת Sanger | רצפי יצירת ארוכים יותר מרצפי NGS. |
סיכום – NGS vs Sanger Sequencing
NGS ו-Sanger Sequencing הן טכניקות רצף נוקלאוטידים בשימוש נרחב בביולוגיה מולקולרית. רצף Sanger היא שיטת רצף מוקדמת שהוחלפה ב-NGS. ההבדל העיקרי בין NGS ל-Sanger Sequencing הוא ש-NGS הוא תהליך מהיר, מדויק וחסכוני יותר מאשר Sanger Sequencing.שתי הטכניקות יצרו התפרצויות גדולות בגנטיקה וביוטכנולוגיה.
