הבדל מפתח – ניטרוצלולוזה לעומת PVDF
Western blotting היא שיטה המאפשרת זיהוי וכימות של חלבונים ספציפיים מדגימת חלבון. אמינות הטכניקה תלויה בבחירת ממברנה נכונה לספיגת חלבונים מהג'ל. ישנם סוגים שונים של ממברנות מיקרו-נקביות. ממברנות ניטרוצלולוזה ו-PVDF הן שתי ממברנות כאלה המועדפות על ידי החוקרים בשל תכונותיהן המיוחדות על פני סוגי הממברנות האחרות. הבחירה בין ניטרוצלולוזה או PVDF היא גם אתגר נוסף ב-Western blotting. גם לניטרוצלולוזה וגם ל-PVDF יש יכולת ספיגת חלבון גבוהה.ההבדל העיקרי בין ניטרוצלולוזה לממברנת PVDF הוא שלממברנות ניטרוצלולוזה אין את היכולת להסיר נוגדנים ולעשות שימוש חוזר בממברנה לצורך בדיקה חוזרת של נוגדנים בעוד שלממברנות PVDF יש יכולת הפשטה ושימוש חוזר.
מה זה ניטרוצלולוזה?
ניטרוצלולוזה הוא פולימר המיוצר על ידי טיפול בתאית בחומצה חנקתית ומשמש לייצור ממברנות מיקרו-נקביות בביולוגיה מולקולרית, במיוחד לטכניקות סופג כמו ספיגה דרומית, צפונית ומערבית. גודל הנקבוביות של ממברנות ניטרוצלולוזה נע בין 3 ל-20 מיקרומטר. ממברנות מיקרו-נקביות של ניטרוצלולוזה מקלות על זיהוי התגובה האימונוכימית המתרחשת על פני הממברנה. לכן, ממברנות ניטרוצלולוזה משמשות לעתים קרובות עבור אימוביליזציה של חלבונים וזיהוי של חלבונים ספציפיים ב-Western blotting. ממברנות ניטרוצלולוזה יכולות גם לשבש גליקופרוטאין וחומצות גרעין.
ממברנות ניטרוצלולוזה מועדפות במבחני זרימה לרוחב עקב מספר תכונות.ממברנות ניטרוצלולוזה סופגות חלבונים בריכוז גבוה. הממס המשמש להרטיב את הממברנה אינו מפחית את ספיגת החלבון של ממברנת הניטרוצלולוזה. ניתן לחתוך בקלות ממברנות ניטרוצלולוזה לגודל הג'ל הרצוי ולהעביר חלבונים מהג'ל לממברנה באמצעות העברה חשמלית או נימית. ניטרוצלולוזה מאפשרת זרימה מהירה יותר של חלבונים דרך הממברנה עם פוטנציאל קשירה גבוה. ניטרוצלולוזה מראה חוזק טיפול משופר. תכונה מיוחדת נוספת של ממברנת ניטרוצלולוזה היא שניתן להדביק אותה בקלות עם דבקים עמידים במים שאינם ממיסים על גבי גב פלסטיק שונים.
איור 01: קרום ניטרוצלולוזה ל-Western blotting
מה זה PVDF?
Polyvinylidene difluoride (PVDF) הוא פלואורפולימר המיוצר על ידי פילמור של וינילידן דיפלואוריד ובעל יכולת אימוביליזציה גבוהה של חלבונים.לכן, ממברנות מיקרופורוסיות העשויות מ-PVDF משמשות בטכניקות סופג מערביות כדי לנתח חלבונים ספציפיים מתערובות החלבונים. ניתן להשתמש בממברנות PVDF גם לניתוח חומצות אמינו ורצף חלבונים. המאפיין החשוב ביותר של ממברנת PVDF על פני ממברנת ניטרוצלולוזה היא שניתן להסיר אותה בקלות מהנוגדנים ולעשות שימוש חוזר עבור בדיקות נוגדנים עוקבות.
ממברנות PVDF עבות יותר ממברנות ניטרוצלולוזה; לפיכך, עמיד יותר בפני נזקים במהלך שימוש חוזר. ממברנות PVDF הינן הידרופוביות ביותר. לכן, יש להשרות אותם במתנול או באיזופרופנול לפני השימוש.
מה ההבדל בין ניטרוצלולוזה ל-PVDF?
ניטרוצלולוזה לעומת PVDF |
|
| ניטרוצלולוזה הוא פולימר המורכב מתאית. | PVDF הוא פלואורפולימר המיוצר על ידי פילמור של וינילידן דיפלואוריד. |
| גודל נקבוביות ממברנה | |
| גדלים טיפוסיים של נקבוביות הם 0.1, 0.2 או 0.45μ | גדלים טיפוסיים של נקבוביות הם 0.1, 0.2 או 0.45μm |
| קיבולת חלבון | |
| לניטרוצלולוזה קיבולת קשירת חלבון של 80 עד 100 מיקרוגרם/ס"מ2. | PVDF קיבולת קשירת חלבון של 170 עד 200 מיקרוגרם/ס"מ2. |
| רגישות | |
| יש לזה רגישות נמוכה בהשוואה ל-PVDF. | יש לזה רגישות גבוהה. |
| זיהוי של חלבונים בעלי ביטוי נמוך | |
| מאחר והרגישות נמוכה בממברנות ניטרוצלולוזה, היא אינה מתאימה לזיהוי של חלבונים בעלי ביטוי נמוך. | זה מתאים יותר לזיהוי של חלבונים בעלי ביטוי נמוך בשל הרגישות הגבוהה שלו. |
| רעש רקע | |
| לזה יש רעש רקע נמוך | יש לרעש רקע גבוה יותר. |
| אינטראקציות עם חלבונים | |
| מולקולות חלבון נקשרות לממברנות ניטרוצלולוזה באמצעות אינטראקציות הידרופוביות. | חלבונים נקשרים לממברנות PVDF באמצעות אינטראקציות הידרופוביות ודיפוליות. |
| טבע הממברנה | |
| ניטרוצלולוזה שביר ושביר. עם זאת, גרסאות של ניטרוצלולוזה זמינות, והן עמידות. | PVDF עמיד יותר ובעל עמידות כימית גבוהה יותר. |
| יכולת להפשיט ושימוש חוזר | |
| ניטרוצלולוזה עשויה להתקשות בהפשטה וחיטוט מחדש מבלי לאבד את האות. | PVDF הוא אידיאלי עבור חיפוש מחדש ורצף יישומים. |
| התאמה | |
| ניטרוצלולוזה אידיאלית לזיהוי חלבונים במשקל מולקולרי נמוך. | PVDF מתאים יותר לזיהוי חלבונים במשקל מולקולרי גבוה יותר. |
| שימושים אחרים | |
| ניתן להשתמש בניטרוצלולוזה לניתוח חומצות גרעין ולספיגת נקודות/חריצים. | PVDF יכול לשמש עבור רצף חלבונים ומערכות ניתוח שלב מוצק. |
| עלות | |
| זה זול יותר מממברנות PVDF. | זה יקר יותר מממברנות ניטרוצלולוזה. |
| צריך הרטבה מוקדמת | |
| ממברנות ניטרוצלולוזה אינן דורשות השרייה מראש עם מתנול | ממברנות PVDF דורשות השרייה מראש עם מתנול. |
סיכום – ניטרוצלולוזה מול PVDF
ממברנות ניטרוצלולוזה היו הממברנות הראשונות בשימוש מסחרי לבדיקת זרימה לרוחב. יש להם יכולת גבוהה לספיגת חלבונים. לכן, ממברנות ניטרוצלולוזה משמשות בספיגה מערבית. PVDF הוא סוג נוסף של ממברנה המשמשת בספיגה מערבית ויש לה גם יכולת ספיגת חלבון גבוהה. שני הסוגים משמשים בספיגה מערבית לניתוח חלבון. עם זאת, לממברנות PVDF יש תכונות מיוחדות יותר, מה שהופך אותן למתאים יותר ממברנות ניטרוצלולוזות עבור סופג מערבי. אבל, ממברנות ניטרוצלולוזה מתאימות יותר לזיהוי חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך, ממברנות PVDF מתאימות יותר לזיהוי חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה.זה ההבדל בין ממברנות ניטרוצלולוזה לממברנות PVDF.
