הבדל מפתח - RT PCR לעומת QPCR
תגובת שרשרת פולימראז היא טכניקה המשמשת להגברת אזור ספציפי של DNA במבחנה. בשל המצאת הטכניקה הזו על ידי קארי מוליס ב-1983, מדענים מסוגלים ליצור אלפי עד מיליוני עותקים של שברי DNA ספציפיים למטרות מחקר. כיום היא הפכה לטכניקה נפוצה ומבוצעת באופן שגרתי במעבדות קליניות ומחקר עבור מגוון רחב של יישומים. ישנן וריאציות של טכניקת PCR מסורתית כגון RT PCR, Nested PCR, Multiplex PCR, Q PCR, RT – QPCR וכו'. RT PCR ו-Q PCR הן שתי וריאציות חשובות של PCR. ההבדל העיקרי בין RT PCR ל-Q PCR הוא ש-RT PCR משמש לאיתור ביטוי גנים באמצעות יצירת תעתיקי DNA (cDNA) משלימים מ-RNA בעוד Q PCR משמש למדידה כמותית של מוצרי PCR בזמן אמת באמצעות צבעים ניאון.
מהו RT PCR?
תגובת שרשרת פולימראז עם תעתוק הפוך (RT PCR) היא גרסה של PCR המשמשת לזיהוי ביטוי RNA. זוהי שיטה חשובה מאוד לזיהוי ביטוי mRNA ברקמות. RT PCR משמש כאשר חומר המוצא של הדגימה הוא RNA. ב-RT PCR, ה-mRNA של התבנית מומר תחילה ל-DNA משלים. שלב זה מזורז על ידי האנזים תעתיק הפוך והתהליך ידוע בתור שעתוק הפוך. שנית, PCR מסורתי משמש עבור ה-cDNA החדש שסונתז לצורך ההגברה.
RT PCR היא טכניקה רגישה מאוד הדורשת כמות קטנה יחסית של דגימת RNA. RT PCR משמש בדרך כלל באבחון וכימות של מיני RNA, במיוחד נגיפי RNA כגון וירוס כשל חיסוני אנושי ווירוס הפטיטיס C.
איור 01: טכניקת RT PCR
מה זה QPCR?
Quantitative PCR (QPCR) הוא גרסה של PCR המשמשת למדידה כמותית של תוצרי PCR. זה מכונה גם תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת מכיוון שהוא מודד את ההגברה של זמן אמת באמצעות מכונת PCR בזמן אמת. זוהי שיטה מתאימה לקביעת כמות רצף מטרה או גן הנמצאים בדגימה. המאפיין המעניין של QPCR הוא שהוא משלב הן הגברה והן כימות אמיתי לשלב אחד. לכן, ניתן לבטל את הצורך באלקטרופורזה בג'ל בזיהוי באמצעות טכניקת QPCR. QPCR משתמש בצבעי ניאון כדי לתייג מוצרי PCR במהלך תגובות ה-PCR אשר מובילות בסופו של דבר לכימות ישירה. כאשר תוצרי ה-PCR מצטברים, מצטברים גם אותות הפלורסנט וזה יימדד על ידי מכונת הזמן האמיתי. ניתן לשלב QPCR עם RT PCR. היא מכונה RT – QPCR או QRT – PCR ונחשבת כשיטה חזקה, רגישה וכמותית ביותר לזיהוי רמות RNA בתאים או ברקמות.
SYBR גרין וטקמן הן שתי שיטות המשמשות לזיהוי או צפייה בתהליך ההגברה של ה-PCR בזמן אמת. שיטת SYBR Green מתבצעת באמצעות צבע ניאון הנקרא ירוק SYBR ומזהה את ההגברה על ידי קשירת הצבע לייצור DNA גדילי כפול. Taqman מתבצעת באמצעות בדיקות עם תווית כפולה ומזהה את ההגברה על ידי פירוק הבדיקה על ידי Taq פולימראז ושחרורים של הפלואורופור כפי שמוצג באיור 02. שתי השיטות עוקבות אחר התקדמות תהליך ההגברה ומדווחות על כמות המוצר בזמן אמת.
ל-PCR בזמן אמת יש מגוון רחב של יישומים כגון כימות ביטוי גנים, ניתוח מיקרו-RNA ו-RNA לא מקודד, גנוטיפ SNP, זיהוי וריאנטים של מספר העתקים, זיהוי מוטציות נדירות, זיהוי אורגניזמים מהונדסים גנטית, זיהוי של גורמים זיהומיים וכו'
איור 02: טכניקת PCR כמותית
מה ההבדל בין RT PCR ל-QPCR?
RT PCR לעומת QPCR |
|
| RT PCR היא טכניקה המשמשת לזיהוי ביטוי גנים על ידי הגברה. | QPCR היא טכניקה המגבירה DNA ומכמתת את תוצרי ה-PCR בזמן אמת. |
| מעורבות של אנזים תעתיק הפוך | |
| תעתיק הפוך של אנזים משמש ל-RT PCR. | תעתיק הפוך של אנזים אינו בשימוש עבור QPCR. |
| שימוש במולקולות עם תיוג פלואורסצנטי | |
| צבעים או בדיקות עם תיוג פלואורסצנטי אינם משמשים עבור RT PCR. | צבעים או בדיקות עם תיוג פלואורסצנטי משמשים עבור QPCR. |
| כימות של מוצר PCR | |
| אלא אם כן משולב עם QPCR, RT PCR אינו מכמת את המוצר PCR. | QPCR למדוד כמותית את תוצר ה-PCR. |
| חומר התחלה | |
| חומר המוצא הוא mRNA. | חומר המוצא הוא DNA. |
| סינתזה של cDNA | |
| DNA משלים מיוצר במהלך RT PCR. | DNA משלים אינו מופק במהלך QPCR. |
סיכום – RT PCR לעומת QPCR
RT PCR ו-QPCR הן שתי גרסאות של PCR מסורתי. טכניקת RT PCR מבוצעת עבור דגימות mRNA והיא מונעת על ידי שעתוק הפוך וייצור cDNA. QPCR משמש לכימות מוצרי PCR במהלך המחזורים התרמיים של PCR בזמן אמת באמצעות צבעים פלורסנטים או בדיקות שכותרתו. ב-QPCR, כמות תוצר ה-PCR מיוצגת על ידי האותות הפלורסנטים הנפלטים על ידי המדגם. RT PCR משמש בדרך כלל כתהליך הגברה ואילו QPCR משמש בדרך כלל כתהליך כימות. זה ההבדל בין RT PCR ל-QPCR.
