ההבדל העיקרי בין מבחני PCR קונבנציונליים למבחני PCR בזמן אמת הוא ש-PCR קונבנציונלי הוא טכניקה שפותחה להגברת רצפים ספציפיים של DNA ו-PCR מקונן הוא שינוי של PCR קונבנציונלי המורכב משתי תגובות הגברה עוקבות, בעוד אמיתי -זמן PCR הוא גרסה של PCR קונבנציונלי המסוגל לכמת את המוצר המוגבר.
PCR היא טכניקה מדעית נפוצה מאוד בשימוש נרחב במחקר וברפואה לאיתור DNA. בדיקות PCR משמשות לאיתור אנטיגנים על ידי זיהוי ה-DNA או ה-RNA שלהם. בדרך כלל, RNA ויראלי קיים בגוף לפני גילוי נוגדנים או הצגת תסמיני המחלה.בדיקת PCR יכולה לדעת אם למישהו יש את הנגיף בשלב מוקדם או לא. נכון לעכשיו, PCR הוא הבדיקה הסטנדרטית לגילוי מחלת COVID-19. ישנם סוגים שונים של טכניקות PCR כגון PCR בזמן אמת, PCR מקונן, PCR מרובי, PCR התחלה חמה ו-PCR לטווח ארוך וכו'.
מהם מבחני PCR קונבנציונליים?
בדיקת PCR קונבנציונלית היא טכניקת הגברה של DNA במבחנה המבוצעת באופן שגרתי במעבדות ביולוגיות מולקולריות. שיטה זו אפשרה ייצור של אלפי עד מיליוני עותקים של שבר DNA מסוים. קארי מוליס הציגה טכניקה זו בשנת 1980. טכניקה זו דורשת קטע DNA המכונה התבנית על מנת ליצור עותקים רבים שלו. Taq polymerase פועל כאנזים DNA פולימראז ומזרז את הסינתזה של גדילים חדשים של רצף התבנית.
פריימרים בתערובת ה-PCR יפעלו כנקודות ההתחלה להרחבות השברים. כל המרכיבים הדרושים להכנת עותקים של DNA כלולים בתערובת ה-PCR.תגובת PCR מופעלת במכונת PCR, ויש להזין אותה בתערובת PCR הנכונה ובתוכנית PCR הנכונה. אם תערובת התגובה והתוכנית נכונים, היא תפיק את המספר הנדרש של עותקים של קטע מסוים של DNA מכמות קטנה מאוד של DNA.
איור 01: בדיקת PCR קונבנציונלית
יש שלושה שלבים עיקריים המעורבים בתגובת PCR: דנטורציה, חישול פריימר והארכת גדיל. שלושת השלבים הללו מתרחשים בשלוש טמפרטורות שונות. מאגר PCR שומר על התנאים האופטימליים לפעולת הפולימראז של Taq. שלושת השלבים הללו של תגובת PCR חוזרים על עצמם כדי לייצר את הכמות הנדרשת של תוצר ה-PCR. בכל תגובת PCR, מספר עותקי ה-DNA מוכפל.לפיכך, ניתן לראות הגברה אקספוננציאלית ב-PCR. מוצר PCR יכול להיפתר באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל מכיוון שהוא מייצר כמות נראית לעין של DNA על ג'ל, וניתן לטהר אותו למחקרים נוספים כגון רצף.
PCR הוא כלי רב ערך במחקר רפואי וביולוגי. במיוחד במחקרים משפטיים, ל-PCR יש ערך עצום מכיוון שהוא יכול להגביר DNA למחקרים מהדגימות הזעירות של הפושעים וליצור פרופילי DNA משפטיים. PCR נמצא בשימוש נרחב בתחומים רבים של ביולוגיה מולקולרית, כולל גנוטיפ, שיבוט גנים, זיהוי מוטציות, רצף DNA, מיקרו-מערכי DNA ובדיקות אבהות.
מהם מבחני PCR מקוננים?
Nested PCR הוא סוג של PCR שמפחית את ההגברה הלא ספציפית של DNA. ישנם שני PCR עוקבים או שתי תגובות הגברה עוקבות בבדיקת PCR מקוננת. במהלך תגובת ההגברה הראשונה, מיוצר מוצר PCR. לאחר התגובה הראשונה, מתבצעת תגובת הגברה שנייה על תוצר ה-PCR של התגובה הראשונה.לכן, פריימרים בתערובת התגובה השנייה נקשרים לתוצר ה-PCR הראשון ומגבירים אותו.
איור 02: PCR מקונן
צמדי פריימר שונים בכל תגובה. הקישור הלא ספציפי של פריימרים מופחת ב-PCR מקוננת. מבחני PCR מקוננים שימושיים להגברת הרגישות ו/או הספציפיות. עם זאת, PCR מקונן דורש ידע על הרצף המעוניין.
מהם מבחני PCR בזמן אמת?
-PCR בזמן אמת או PCR כמותי (Q PCR) הוא גרסה שונה של PCR המודדת את תוצרי ה-PCR באופן כמותי. לכן, טכניקה זו מכמתת את ההגברה בזמן אמת באמצעות מכונת PCR בזמן אמת. זוהי גם שיטה מתאימה לקביעת כמות רצף מטרה או גן הנמצאים בדגימה.
התכונה המעניינת של PCR בזמן אמת היא שהוא משלב גם הגברה וגם כימות אמיתי לשלב אחד. לכן, ניתן לבטל את הצורך באלקטרופורזה ג'ל לגילוי באמצעות טכניקת PCR בזמן אמת. השימוש בצבעי פלורסנט לסימון מוצרי PCR במהלך תגובות ה-PCR יוביל בסופו של דבר לכימות ישירה. כאשר תוצרי ה-PCR מצטברים, מצטברים גם אותות הפלורסנט, והם יימדדו על ידי מכונת זמן אמת. SYBR Green ו-Takman הן שתי שיטות לזיהוי או צפייה בתהליך ההגברה של ה-PCR בזמן אמת. שתי השיטות עוקבות אחר התקדמות תהליך ההגברה ומדווחות על כמות המוצר בזמן אמת.
איור 03: PCR בזמן אמת
ל-PCR בזמן אמת יש מגוון רחב של יישומים כגון כימות ביטוי גנים, ניתוח מיקרו-RNA ו-RNA שאינו מקודד, גנוטייפ SNP, זיהוי וריאנטים של מספר העתקים, זיהוי מוטציות נדירות, זיהוי אורגניזמים מהונדסים גנטית, ו זיהוי של גורמים מדבקים.
מהם הדמיון בין מבחני PCR קונבנציונליים ובין מבחני PCR בזמן אמת?
- מבחני PCR מקוננים ובזמן אמת הם שינויים של מבחני PCR קונבנציונליים.
- כל שלוש הטכניקות מגבירות דגימות DNA.
- המוצרים שלהם יכולים לשמש ברצף או ניתוח.
- מבחנים אלה דורשים פריימרים.
מה ההבדל בין מבחני PCR קונבנציונליים לבין מבחני PCR בזמן אמת?
PCR קונבנציונלי היא טכניקה שפותחה להגברת רצפים ספציפיים של DNA. בינתיים, Nested PCR הוא שינוי של PCR קונבנציונלי המורכב משתי תגובות הגברה עוקבות, ו-PCR בזמן אמת הוא גרסה של PCR קונבנציונלי המסוגל לכמת את המוצר המוגבר.אז זהו ההבדל העיקרי בין מבחני PCR קונבנציונליים ובין מבחני PCR בזמן אמת. שלא כמו PCR קונבנציונלי ובזמן אמת, PCR מקונן משתמש בשתי ערכות פריימר. יתר על כן, ישנן שתי תגובות הגברה עוקבות ב-PCR מקוננות על מנת להפחית הגברה לא ספציפית. חוץ מזה, מבחני PCR קונבנציונליים ובזמן אמת אינם מכילים שתי תגובות הגברה עוקבות.
האינפוגרפיקה הבאה מפרטת את ההבדלים בין מבחני PCR קונבנציונליים מקוננים ובין מבחני PCR בזמן אמת בצורה טבלה להשוואה זה לצד זה.
סיכום – מבחני PCR קונבנציונליים לעומת מקוננים לעומת בזמן אמת
PCR קונבנציונלי היא הטכניקה הראשונה שפותחה להגברת מקטעים ספציפיים של DNA. PCR מקונן ו-PCR בזמן אמת הם שתי גרסאות של PCR קונבנציונלי. ישנן שתי תגובות הגברה עוקבות ושימוש בשני ערכות פריימר ב-PCR מקוננות. PCR בזמן אמת פותח כדי לכמת את מוצר ה-PCR המוגבר. לפיכך, זה מסכם את ההבדל בין מבחני PCR קונבנציונליים לבין מבחני PCR בזמן אמת.
