PCR לעומת PCR בזמן אמת
PCR או Polymerase שרשרת הוא תגלית מהפכה בביולוגיה מולקולרית מודרנית, אשר פותחה לראשונה על ידי הכימאי קארי מוליס בשנת 1983. היא מאפשרת להגביר רצף בודד ב-DNA מורכב לצורך ניתוח. הרעיון הבסיסי של ה-PCR הוא ששני פריימרים, המשלימים לגדילים ההפוכים של רצף DNA, מכוונים זה לזה; הפריימרים מייצרים גדילים משלימים, שכל אחד מכיל את הפריימר השני. מכאן שהתוצאה היא כמות גדולה של רצף התואם ל-DNA שנמצא בין שני הפריימרים. אנזים DNA פולימראז משמש להארכת הפריימרים ב-PCR. DNA פולימראז הוא אנזים יציב תרמי, ויש לו את היכולת לשרוד בטמפרטורות גבוהות (94 עד 95 מעלות צלזיוס) המשמשות לדנטורציה של DNA תבנית.
ה-PCR כולל שלושה שלבים, כלומר, סבבים חוזרים של דנטורציה, חישול של פריימרים וסינתזה של DNA. מכונת thermocycler משמשת לביצוע תגובה זו כך שניתן לתכנת אותה לשנות את הטמפרטורות במהירות ובדייקנות. היישומים של ה-PCR הם חקירות פליליות, טביעת אצבע של DNA, גילוי פתוגנים וניתוח DNA של מינים אנושיים מוקדמים.
מהו PCR קונבנציונלי?
יש שלושה שלבים עיקריים של PCR קונבנציונלי, כלומר; שלב הגברה של DNA, הפרדת PCR וזיהוי מוצרים. הפרדת מקטעי DNA נעשית בדרך כלל על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. לאחר מכן, המוצרים נצבעים בברומיד אתידוים. לבסוף, זיהוי מושג על ידי הדמיה של להקות על גבי ג'לים תחת אור UV. לכן, התוצאות הסופיות של PCR קונבנציונלי אינן מבוטאות כמספרים.בדרך כלל, ה-PCR הרגיל מסוגל לזהות רק פרמטר בודד.
מהו PCR בזמן אמת?
PCR בזמן אמת יכול לזהות את ההגברה של מוצרים, כאשר המוצרים מסונתזים. עם התפתחות הטכנולוגיה, PCR הפך לטכניקה פופולרית מאוד, במיוחד לאיתור וזיהוי של חיידקים במזון. ה-PCR בזמן אמת משתמש במערכת צבע פלורסנט ובתרמוסיקלר המצויד ביכולת זיהוי פלורסנט.
מה ההבדל בין PCR קונבנציונלי ל-PCR בזמן אמת?
• PCR קונבנציונלי גוזל יותר זמן מכיוון שהוא משתמש באלקטרופורזה של ג'ל כדי לנתח את מוצרי ה-PCR המוגברים. לעומת זאת, PCR בזמן אמת גוזל פחות זמן מכיוון שהוא יכול לזהות הגברות בשלבים המוקדמים של התגובה.
• PCR בזמן אמת אוסף נתונים בשלב הצמיחה האקספוננציאלי של PCR בעוד שה-PCR המסורתי אוסף נתונים בנקודת הסיום של התגובה.
• ייתכן שתוצאות נקודת הסיום של ה-PCR הרגיל אינן מדויקות במיוחד, אבל התוצאות של ה-PCR בזמן אמת מדויקות מאוד.
• PCR בזמן אמת רגיש יותר מ-PCR רגיל.
• ל-PCR קונבנציונלי יש רזולוציה גרועה מאוד בעוד ש-PCR בזמן אמת יכול לזהות שינויים מועטים מאוד בגלל הרזולוציה הגבוהה.
• לזיהוי נקודת קצה של PCR קונבנציונלי יש טווח דינמי קצר ואילו לזיהוי PCR בזמן אמת יש טווח דינמי רחב.
• שלא כמו PCR קונבנציונלי, טכניקות זיהוי אוטומטי נמצאות ב-PCR בזמן אמת.
• PCR קונבנציונלי הוא מאוד מתוחכם ועתיר עבודה יותר מ-PCR בזמן אמת.
• בניגוד ל-PCR בזמן אמת, PCR קונבנציונלי אינו יכול להבחין בין חיידקים מתים לחיים.
• PCR בזמן אמת משתמש במערכת צבע פלואורסצנטי כדי לזהות את המוצרים בעוד שה-PCR קונבנציונלי משתמש באתידיום ברומיד ובאור UV כדי להמחיש פסים במדיום ג'ל אגרוז.
