הבדל מפתח – פריימרים PCR לעומת פריימרים לרצף
עם ההתפתחויות האחרונות בתחום הביולוגיה המולקולרית, פותחו טכניקות גנטיות שונות שהפכו את תהליכי החקירה באפיקים שונים של הנושא לקלים ומדויקים. PCR והליכי רצף אחרים הם שתי טכניקות חשובות כאלה. הם משתמשים ברכיבי משנה שונים. פריימרים נחשבים כתת-הרכיב העיקרי המשותף הן לטכניקות PCR והן לטכניקות רצף. primers PCR משמשים להגברה של רצף DNA מסוים בעוד שפריימרים לרצף משמשים בהקשר של רצף קטע DNA מתוך כוונה לחשוף את הסדר הספציפי שלו של רצף הנוקלאוטידים.זהו ההבדל העיקרי בין פריימרים ל-PCR לבין פריימרים לרצף.
מה הם PCR Primers?
תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא טכניקה גנטית המשמשת בתחום הביולוגיה המולקולרית על מנת להגביר עותקים בודדים או מעטים של מקטע DNA מסוים ולהשיג מיליונים רבים של עותקים זהים. בתגובת PCR משתמשים ברכיבים שונים כולל פריימרים. פריימרים הם גדילי DNA קצרים עם אורך נוקלאוטיד של 18-25 מה שהופך אותם לתואמים לאזור ההתחלה והסוף של שברי ה-DNA שיש להגביר. פריימרים יכולים להיות פריימר קדימה ופריימר הפוך. פריימרים אלו נקשרים למקטע ה-DNA בנקודות הספציפיות בהן הוא גורם ל-DNA פולימראז להיקשר לפריימר הספציפי במקום ולהתחיל את הסינתזה של גדיל ה-DNA החדש.
בחירת הפריימרים היא היבט חשוב בתהליך ה-PCR. בחירת אורך הפריימר חשובה. האורך האידיאלי יהיה 18-25 נוקלאוטידים.אם האורך קצר מדי או ארוך מדי, הפריימרים לא ייקשרו לרצף ה-DNA כדי להיות מוגבר בצורה מדויקת. פריימרים קצרים מדי באורכם מובילים ל-primer annealing לא ספציפי במיקומים שונים של רצף ה-DNA.
איור 01: פריימר PCR
תכולת הגואנין והציטוזין (GC) בפריימר טוב צריכה להיות בטווח של 40-60. טמפרטורת חישול הפריימר וטמפרטורת ההיתוך הם גורמים חיוניים במהלך PCR. יש לחשב את טמפרטורת ההיתוך במדויק, וטמפרטורת חישול הפריימר צריכה להיות 5 0C פחות מטמפרטורת ההיתוך. טמפרטורת ההיתוך צריכה להיות 60 מעלות צלזיוס ו-75 מעלות צלזיוס. טמפרטורות גבוהות מדי או נמוכות מדי יגרמו לפעילות פחות פעילה של DNA פולימראז.
מהם פריימרים לרצף?
פריימרים לרצף משמשים בהקשר של ריצוף של קטע DNA מתוך כוונה לחשוף את זהותו הספציפית. כדי להשיג תוצאות רצף טובות חשובים פריימרים ותבניות באיכות גבוהה. לפיכך, כאשר בוחרים פריימרים, הם צריכים להיות ייחודיים לאזור מסוים שבו אנו רוצים לרצף. זה גם צריך להיות עם כיוון נכון שבו הרצפים נוצרים בדרך כלל מקצוות 3' עד 5' של הפריימרים. הרצף צריך להיות חסר הכלאה עצמית בלתי רצויה כגון היווצרות לולאות סיכת ראש. זה לא צריך להכיל היווצרות רצופה של בסיסי גואנין.
טמפרטורת ההיתוך (Tm) של הפריימר חייבת להיות מתאימה לתנאי הרצף. לכן, הוא צריך להיות בין 52oC ל-74oC. יש לטהר הכנת אוליגונוקלאוטידים לשימוש כפריימר כדי להשיג את הרצף באורך מלא הרצוי. אם האוליגונוקלאוטידים מכילים זיהומים, איתות רצף הפריימר יוצב מאתרי פרימה שונים, והוא גם יקטין את מספר תאי הבסיס.
איור 02: פריימרים לרצף
טמפרטורת ההתכה של הפריימר (Tm) של אוליגונוקלאוטיד קובעת כמה חזקות גדילי ה-DNA המשלימים עוברים הכלאה זה עם זה. Tm יכול להיחשב כחישוב תרמודינמי שבו הוא תלוי בשני רצפי DNA ובמספר תנאים כגון ריכוז מלח. ה-Tm חשוב במהלך PCR כאשר וריאנט הנקרא רצף מחזור משמש לייצור קבוצה של מקטעים עם סיומת dideoxynucleotide. כאן, הפריימר שרצף יעבור תחילה חישול לחלופין, לאחר מכן יורחב ולבסוף יפונה להגברה. לכן, ערך Tm צריך להיות בין 52oC ו-74o C. ניתן להשיג אוליגונוקלאוטידים מסונתזים ממעבדות סינתזת DNA/RNA לפי הוראות בְּחִירָה.קנה המידה הקטן של סינתזה המשמש לרצף DNA הוא בדרך כלל 50 ננומול. כמו כן, הכי חשוב יש לטהר את הפריימרים המשמשים לרצף כך שיהיו נקיים מזיהומים שימנעו את הפחתת האיכות.
מהם הדמיון בין פריימרים PCR ל-Serquecing Primers?
- שניהם PCR Primers ו-Sequencing Primers הם פריימרים המשמשים בתהליך ההגברה של רצף DNA ממוקד.
- שניהם PCR Primers ו-Sequencing Primers מורכבים מנוקלאוטידים.
- שניהם PCR Primers ו-Sequencing Primers הם אוליגומרים קצרים.
מה ההבדל בין פריימרים PCR ל-Serquecing Primers?
PCR Primers vs Sequencing Primers |
|
| PCR פריימרים הם גדילי DNA קצרים עם אורך רצף נוקלאוטידים של 18-25 מה שהופך אותם תואמים לאזור ההתחלה והסוף של שברי ה-DNA שיש להגביר. | פריימרים לרצף הם אוליגומרים קצרים המשמשים בהקשר של רצף של קטע DNA מתוך כוונה לחשוף את זהותו הספציפית. |
| פונקציה | |
| PCR פריימרים משמשים להגברה של רצף DNA מסוים. | פריימרים לרצף משמשים בהקשר של ריצוף של קטע DNA מתוך כוונה לחשוף את זהותו הספציפית. |
| מספר הפריימרים הדרושים | |
| שני פריימרים; פריימר אחד קדימה ופריימר אחד לאחור משמשים בתור פריימר PCR. | צריך רק פריימר אחד בתור פריימר לרצף. |
סיכום – Primers PCR לעומת Primers Sequencing
פריימרים לרצף משמשים בהקשר של ריצוף של קטע DNA מתוך כוונה לחשוף את זהותו הספציפית.פריימר רצף אחד יספיק כדי להפעיל את התהליך. כדי להשיג תוצאות רצף טובות, חשובים פריימרים ותבניות באיכות גבוהה. לפיכך, כאשר בוחרים פריימרים, הם צריכים להיות ייחודיים לאזור מסוים שבו אנו רוצים לרצף. פריימרים של PCR הם גדילי DNA קצרים באורך נוקלאוטיד של 18-25 התואם את אזור ההתחלה והסוף של שברי ה-DNA שיש להגביר. פריימר PCR יכול להיות פריימר קדימה ופריימר הפוך. תכולת הגואנין והציטוזין (GC) בפריימר טוב צריכה להיות בטווח של 40-60. טמפרטורת חישול הפריימר וטמפרטורת ההיתוך הם היבטים חיוניים במהלך PCR. זה ההבדל בין פריימרים של PCR לבין פריימרים לרצף.
