הבדל מפתח - שיבוט גנים לעומת PCR
הסינתזה של עותקים רבים של DNA ממקטע DNA ספציפי נקראת הגברה של DNA. ישנם שני תהליכי הגברה עיקריים של DNA, כלומר שיבוט גנים ו-PCR. ההבדל העיקרי בין שיבוט גנים ל-PCR הוא, שיבוט גנים מייצר את העותקים המרובים של גן ספציפי in vivo על ידי בניית DNA רקומביננטי וגידול בתוך חיידק מארח בעוד PCR מייצר מיליוני עותקים של שבר DNA ספציפי במבחנה שעוברים מחזורים חוזרים של דנטורציה וסינתזה.
מהו שיבוט גנים?
שיבוט גנים הוא טכניקה המשמשת לאיתור והכפלה של גן ספציפי מה-DNA הגנומי המופק של אורגניזם באמצעות בניית DNA רקומביננטי. DNA גנומי מכיל אלפי גנים שונים המקודדים לחלבונים. כאשר ה-DNA מופק, הוא כולל את כל הגנים האפשריים שהוא יכול לשאת. טכניקת שיבוט גנים אפשרה זיהוי של גן ספציפי מכלל ה-DNA. לכן שיבוט גנים משמש ככלי חשוב בביולוגיה מולקולרית.
יצירת ספרייה גנומית של אורגניזם חיונית בשיבוט גנים אם אין רמז לגבי מיקומו של הגן הרלוונטי ב-DNA. ספרייה גנומית נוצרת באמצעות השלבים הבאים.
שלב 1: מיצוי ה-DNA הכולל מאורגניזם המכיל את הגן הרצוי.
שלב 2: עיכול הגבלה של ה-DNA המופק כדי לייצר שברים קטנים שניתנים לניהול. שלב זה מבוצע על ידי אנדונוקלאזות הגבלה.
שלב 3: בחירת וקטור מתאים ופתיחת ה-DNA הווקטור באמצעות אותם אנדונוקלאזות הגבלה. פלסמידים חיידקיים משמשים בדרך כלל כווקטורים לשאת DNA זר. פלסמידים הם עיגולים קטנים של DNA הממוקמים בתוך חיידקים.
שלב 4: שילוב של ה-DNA הווקטור וה-DNA המפוצל לייצור מולקולת DNA רקומביננטית. שלב זה נשלט על ידי DNA ligase.
שלב 5: העברת מולקולות DNA רקומביננטיות לחיידקים מארח. שלב זה מכונה טרנספורמציה, והוא נעשה באמצעות הלם חום.
שלב 5: הקרנה של תאי חיידקים שעברו טרנספורמציה על מצע תרבות. אוכלוסייה מעורבת של תאים מאכסנים שעברו טרנספורמציה ולא שעברו טרנספורמציה מתקבלת בסוף תהליך הטרנספורמציה. כגן עניין כולל רק בתאי מארח שעברו טרנספורמציה. לפיכך, יש צורך לבחור תאים שעברו טרנספורמציה. הבחירה נעשית באמצעות מדיה סלקטיבית המכילה אנטיביוטיקה. רק התאים שעברו טרנספורמציה גדלים על מדיום ההקרנה הזה המאפשר את הבחירה.
שלב 6: גידול של חיידקים כדי לייצר ספריית גנים. בשלב זה, התאים המארח שעברו טרנספורמציה מוכנסים למדיית תרבות טרייה המספקת דרישות צמיחה אופטימליות. סך המושבות על לוחות התרבית מייצגים את הספרייה הגנומית של אותו אורגניזם.
שלב 7: יש לסנן את מולקולת ה-DNA הרקומביננטי המכילה את הגן המעניין מאלפי מקטעים משובטים של DNA רקומביננטי. ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בבדיקות המסמנות את הגן הספציפי או את התוצאה של החלבון הספציפי מאותו גן.
לאחר זיהוי הגן המעוניין המכיל את מושבת החיידקים מתוך כלל המושבות, ניתן ליצור מיליוני עותקים של הפלסמיד הרקומביננטי המכיל את הגן.
שיבוט גנים משמש בהקמת ספריות גנים, ייצור חלבון מיוחד, ויטמינים, אנטיביוטיקה, הורמונים, ריצוף ומיפוי גנומים של האורגניזמים, הכנת מספר עותקים של DNA של יחידים בזיהוי פלילי וכו'.
Figure_1: שיבוט גנים
מה זה PCR?
תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא טכניקה שיוצרת מספר רב של עותקים של שבר DNA מסוים. הגברה אקספוננציאלית של רצף DNA ספציפי מתקבלת על ידי PCR בתנאי מבחנה. טכניקה זו היא כלי רב עוצמה בביולוגיה מולקולרית מכיוון שהיא יכולה להכפיל דגימה קטנה של DNA לכמות שמישה. PCR הוצג על ידי קארי מוליס ב-1983 וההמצאה עטורת הפרסים הזו יצרה התקדמות עצומה בביולוגיה מולקולרית.
טכניקת PCR עוקבת אחר תגובות PCR חוזרות כפי שמוצג באיור 02. תגובת PCR אחת מורכבת משלושה שלבים עיקריים המתרחשים בשלוש טמפרטורות שונות; דנטורציה של גדילי כפול ב-DNA ב-94 0C, חישול של פריימרים ב-68 0C והתארכות גדיל ב-72 0 C. לכן, כאשר מבוצע PCR, יש לשמור על תנודתיות בטמפרטורה לשכפול תקין. PCR מבוצע במכונת PCR בתוך צינורות PCR. צינורות PCR עמוסים בתערובות PCR נכונות המכילות תבנית DNA, Taq פולימראז, פריימרים, dNTPs ומאגר.דנטורציה של DNA מדגם דו-גדילי ל-DNA חד-גדילי נעשה על ידי שבירת קשרי המימן בין בסיסים משלימים ב-94 - 98 0C. לאחר מכן נחשפים גדילים בודדים של תבנית DNA עבור פריימרים. יש לספק זוג פריימרים (קדימה והיפוך), והם צריכים להיות עמידים בחום כדי לסבול טמפרטורות גבוהות. פריימרים הם רצפי DNA קצרים עם גדילים בודדים המשלימים לקצוות של קטע ה-DNA היעד. משתמשים בפריימרים סינתטיים ב-PCR. פריימרים נקשרים עם הבסיסים המשלימים של ה-DNA המדגם ומתחילים סינתזה של גדיל חדש. שלב זה מזורז על ידי אנזים בשם Taq polymerase; אנזים DNA פולימראז תרמי מבודד מ-Thermus auqaticus. כאשר פריימרים ונוקלאוטידים (אבני בניין) זמינים, Taq polymerase בונה את גדיל ה-DNA החדש המשלים ל-DNA התבנית. בסוף תוכנית ה-PCR, קטע DNA מוגבר נצפה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל. אם נדרש ניתוח נוסף, מוצר PCR מטוהר מהג'ל.
PCR שימושי מאוד לאבחון וניטור של מחלות גנטיות ונרכשות, זיהוי פושעים (בתחום הזיהוי הפלילי), לימוד המבנה והתפקוד של מקטע ממוקד של DNA, ריצוף ומיפוי של גנומים של אורגניזמים, וכו'. PCR הפך לטכניקת מעבדה שגרתית במעבדות מחקר רפואיות וביולוגיה מולקולרית בקרב מדענים מכיוון שיש לה מגוון רחב של יישומים.
Figure_2: תגובת שרשרת פולימראז
מה ההבדל בין שיבוט גנים ל-PCR?
שיבוט גנים לעומת PCR |
|
| שיבוט גנים הוא תהליך של יצירת עותקים מרובים של גן ספציפי in vivo באמצעות DNA רקומביננטי והפיכה לחיידק מארח. | טכניקת PCR מייצרת עותקים מרובים של רצף DNA מסוים במבחנה באמצעות מחזורים חוזרים של תגובות PCR. |
| דרישה לבניית DNA רקומביננטי | |
| DNA רקומביננטי מיוצר על מנת לאתר את הגן. | DNA רקומביננטי אינו מיוצר. |
| Need of Labour | |
| תהליך זה דורש עבודה. | אין צורך בעבודה אינטנסיבית. |
| תהליך In vivo או In vitro | |
| בניית DNA רקומביננטי היא במבחנה וההגברה של DNA היא in vivo. | הגברת ה-DNA מתרחשת לחלוטין במבחנה. |
סיכום – שיבוט גנים לעומת PCR
שיבוט גנים ו-PCR הן שתי שיטות המשמשות להגברת DNA. PCR הוא תהליך במבחנה אשר מייצר עותקים מרובים של DNA של קטע DNA מסוים מבלי להשתמש ב-DNA רקומביננטי ובאורגניזם מארח. שיבוט גנים הוא בעיקר תהליך in vivo אשר מביא למספר עותקים של גן מעוניין בתוך האורגניזם המארח באמצעות בנייה של DNA רקומביננטי. זה ההבדל בין שיבוט גנים ל-PCR.
