הבדל מפתח – שיבוט לעומת תת-שיבוט
שיבוט ותת-שיבוט הם פרוצדורות ביולוגיות מולקולריות היוצרות תאים זהים גנטית או אורגניזמים הנושאים את ה-DNA או הגן המעניינים אותם. שיבוט היא טכניקה הכוללת החדרה של הגן או ה-DNA המעוניין לוקטור, שכפול שלו בתוך חיידק מארח, וייצור של תאים או אורגניזמים שהם עותקים מדויקים של ההרכב הגנטי. תת שיבוט היא טכניקה הכוללת החדרה של הגן המעניין, שכבר מוחדר לווקטור, לוקטור משני, שכפול שלו בתוך חיידק מארח וייצור עותקים זהים מבחינה גנטית של תאים או אורגניזמים.ההבדל העיקרי בין שיבוט לתת-שיבוט הוא שבשיבוט, הגן המעניין, לאחר שקשור לווקטור, ממשיך בתהליך השיבוט בעוד שבתת-שיבוט, הגן המשובט כבר מופרד מהוקטור האב ומוכנס שוב לתוך וקטור נמען והמשך בתהליך.
מהו שיבוט?
שיבוט הוא ההליך שמייצר אורגניזמים או תאים זהים מבחינה גנטית. בטבע, שיבוט מתרחש באמצעי רבייה א-מינית. כאשר אין ריקומבינציה או שינוי גנטי, תאי הבת מקבלים את אותו מבנה גנטי של ההורה. אורגניזמים פרוקריוטיים ואוקריוטיים יוצרים שיבוטים על ידי ביקוע בינארי, ניצנים, מיטוזה וכו'. בביולוגיה מולקולרית, שיבוט גנים או קטעים ספציפיים של DNA היא שיטה פופולרית לחקור את המבנה והתפקוד של קטע DNA מסוים זה.
המטרה העיקרית של שיבוט מולקולרי היא ליצור מיליוני עותקים של תאים זהים גנטית או אורגניזמים הנושאים את קטע ה-DNA המעניין (בעיקר גנים).זה יוצר אורגניזמים עם עותקים גנטיים מדויקים של אחר. בעיקר, גנים ספציפיים משובטים במחקרים מולקולריים כדי לקבל מידע מבני ותפקודי ולריצוף DNA. כמו כן, לייצור חלבונים או מוצרים ספציפיים בקנה מידה גדול, נעשה שימוש נרחב בשיבוט.
נוהל שיבוט
השלבים הבסיסיים של הליך השיבוט הם כדלקמן.
- זיהוי ובידוד של הגן המעניין. (הגברה של הגן המעניין על ידי PCR).
- עיכול הגבלה של הגן המעניין (Restriction endonuclease חתך את הגן).
- עיכול הגבלה של ה-DNA הווקטור. (גם ה-DNA הווקטור נחתך באמצעות אותו אנדונוקלאז הגבלה).
- הכנסת הגן לוקטור ויצירת המולקולה הרקומביננטית.
- המרה של הווקטור הרקומביננטי לחיידק מארח.
- בידוד וזיהוי של החיידקים שעברו טרנספורמציה (וקטור הפלסמיד צריך להכיל גן ניתן לבחירה, לרוב גן עמידות לאנטיביוטיקה למסך חיידקים שעברו טרנספורמציה).
- ביטוי גנים רקומביננטי בתוך המארח.
Figure_01: הליך שיבוט
מהו תת-שיבוט?
תת-שיבוט הוא הליך של העברה של גן מעניין מוקטור אחד לוקטור אחר כדי לראות את הביטוי של הגן כדי להשיג את הפונקציונליות הרצויה של הגן. בשיטה זו מעורבים שני וקטורים; כלומר, וקטור אב ווקטור יעד. משובטים משובטים מועברים שוב לווקטור שני בתת שיבוט. המטרה של העברת הגן מהווקטור הראשון לוקטור השני היא להשיג משהו שלא היה יכול להיעשות על ידי הווקטור הראשון או להפריד שוב גן בתוך המקטע שכבר משובט של DNA ולבטא אותו לבד. אנזימי הגבלה משמשים בהליך זה בהתחלה.
נוהל שיבוט משנה
השלבים הבסיסיים של שיבוט משנה הם כדלקמן.
- בעזרת אנדונוקלאזות הגבלה, הפרדה של ה-DNA המעניין בפלסמיד התורם (וקטור אב).
- הגברה של ה-DNA המעניין באמצעות PCR.
- טיהור של מוצר ה-PCR (DNA מעניין) על ידי אלקטרופורזה של ג'ל.
- פתיחה של הפלסמיד המקבל על ידי אנדונוקלאזים של הגבלה המשמשים להפרדת ה-DNA המעניין בפלסמיד האב.
- קישור של ה-DNA המעניין (גן) לתוך הפלסמיד הנמען כדי ליצור את הפלסמיד המשוכפל.
- טרנספורמציה של הווקטור המשוכפל לחיידק מארח מוכשר.
- הקרנה של תאים שעברו טרנספורמציה.
- טיהור של ה-DNA הפלסמיד ושימוש לרצף DNA או ביטוי של הגנים להשגת המוצרים הרצויים.
תת-שיבוט מתבצע בהזדמנויות של בידוד גן אחד מקבוצת הגנים המשובטים או כאשר הגן המעניין נדרש לעבור לפלסמיד שימושי כדי לראות את התפקוד המדויק של הגן המעניין.
Figure_02: הליך שיבוט משנה
מה ההבדל בין שיבוט לשיבוט משנה?
שיבוט לעומת תת-שיבוט |
|
| שיבוט הוא ההליך שמייצר אורגניזמים או תאים זהים מבחינה גנטית. | תת-שיבוט הוא הליך של העברת גן מעניין מווקטור אחד לוקטור אחר כדי לראות את הביטוי של הגן כדי להשיג את הפונקציונליות הרצויה של הגן. |
| תהליך | |
| הפרד את ה-DNA המעניין מהאורגניזם והוכנס לווקטור פעם אחת ושובט | כבר DNA משובט מופרד מהוקטור הראשון ומוכנס לווקטור שני ומשובט. |
| הוסף תנועה באמצעות וקטורים | |
| אינו מעביר תוספות (DNA של עניין) מוקטור אחד לוקטור אחר. | העבר תוספות מהוקטור אב לוקטור היעד. |
סיכום – שיבוט לעומת תת-שיבוט
שיבוט יוצר תאים או אורגניזמים זהים מבחינה גנטית עם הגן או ה-DNA המוכנסים לעניין. זה ממשיך דרך ההפרדה והחדרה של ה-DNA המעניין לוקטור וביטוי בתוך חיידק מארח. תת-שיבוט חולק שלבים דומים עם שיבוט. עם זאת, בתת שיבוט, קטע DNA שכבר משובט (גן מעניין) מוחדר לווקטור והופך לחיידק מארח. זה ההבדל העיקרי בין שיבוט לשיבוט משנה.
