הבדל מפתח – SYBR Green נגד Taqman
SYBR גרין וטקמן הן שתי שיטות המשמשות לזיהוי או צפייה בתהליך הגברה של PCR בזמן אמת. SYBR Green היא שיטה המבוססת על צבע צביעת חומצות גרעין אינטרקלציה ואילו Taqman היא שיטה המבוססת על פרוב הידרוליזה. שתי הטכנולוגיות נועדו ליצור פלואורסצנטיות במהלך ה-PCR, מה שמאפשר למכונת PCR בזמן אמת לנטר את התגובה "בזמן אמת". שיטת SYBR גרין מתבצעת באמצעות צבע ניאון הנקרא ירוק SYBR ומזהה את ההגברה על ידי קשירת הצבע ל-DNA גדילי כפול. Taqman מתבצע באמצעות בדיקות עם תווית כפולה ומזהה את ההגברה על ידי פירוק הבדיקה על ידי Taq פולימראז ושחרור הפלואורופור.זה ההבדל העיקרי בין SYBR Green ל-Takman.
מה זה SYBR Green?
SYBR ירוק הוא צבע ניאון המשמש לצביעה של חומצות גרעין, במיוחד DNA גדילי כפול בביולוגיה מולקולרית. שיטת SYBR Green משמשת לכימות מוצרי PCR במהלך ה-PCR בזמן אמת. ברגע שהוא נקשר ל-DNA, קומפלקס צבע ה-DNA המתקבל סופג אור כחול ופולט אור ירוק עז. זה קורה עקב השינוי המבני שמתרחש במולקולת הצבע עם הקישור ל-DNA דו-גדילי. כאשר PCR יוצר יותר ויותר DNA, יותר מולקולות צבע נקשרות ל-DNA, ומייצרות יותר פלואורסצנטיות. לכן, הקרינה עולה עם הצטברות המוצר PCR. לפיכך, ניתן למדוד כמותית את כמות תוצר ה-PCR על ידי זיהוי הקרינה הירוק של SYBR.
SYBR צבע ירוק יכול לשמש גם לתיוג DNA בציטומטריה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. אתידיום ברומיד הוחלף בהצלחה על ידי SYBR גרין מאז אתידיום ברומיד הוא צבע מסרטן עם בעיות סילוק במהלך הדמיית DNA באלקטרופורזה של ג'ל.
יש יתרונות וחסרונות של שיטת SYBR הירוקה. שיטה זו רגישה מאוד, זולה וקלה לשימוש. עם זאת, בשל יכולתו להיקשר לכל DNA דו-גדילי, קשירה לא ספציפית יכולה להוביל לכימות יתר של מוצר PCR.
איור 01: SYBR Green Technique
מה זה טקמן?
Taqman היא שיטה חלופית ל-SYBR Green לניטור תהליך PCR בזמן אמת. שיטה זו תלויה בפעילות האקסונוקלאז 5' - 3' של אנזים Taq polymerase כדי לפרק את הבדיקות במהלך הארכת הגדיל החדש ושחרור הפלואורופור. בשיטה זו נעשה שימוש בבדיקות עם תווית כפולה והיא מבוססת על הידרוליזה של בדיקות. בדיקות הן אוליגונוקלאוטידים של DNA עם תיוג פלואורסצנטי בעלי מולקולת כתב ניאון (פלואורופור) בקצה 5' ומולקולת מרווה בקצה 3'.הם מתוכננים להיקשר לתבנית הגדילה הבודדת בצד הנגדי של חישולי הפריימר. פולימראז Taq מוסיף נוקלאוטידים לפריימר ומרחיב את הגדיל החדש לכיוון הבדיקות הכפולות. ברגע שה-Taq פולימראז פוגש את הבדיקה, פעולת האקסונוקלאז של ה-Tak פולימראז מפעילה ומפרקת את הבדיקה. ברגע שהוא משלים את הסינתזה של הגדיל החדש, הבדיקה נתונה לפירוק מוחלט ולשחרר את הפלואורופור. שחרור הפלואורופור יוצר פלואורסצנטיות. מולקולת ה-Quencher הפלורסנטית מכווה ביעילות את האור הנפלט ויוצרת את הפלט לכימות של תוצר ה-PCR. שחרור הפלואורופורים וכמות מוצרי ה-PCR הם פרופורציונליים. לפיכך, ניתן לבצע כימות בקלות בשיטת טקמן.
איור 02: שיטת טקמן
שיטת Taqman משמשת ב-PCR בזמן אמת, כימות ביטוי גנים, זיהוי פולימורפיזם גנטי, כימות מחיקות DNA כרומוזומליות, זיהוי חיידקים, אימות ניתוח מיקרו-מערכים, גנוטיפ SNP וכו'.
מה ההבדל בין SYBR green ל-Takman?
SYBR גרין נגד טקמן |
|
| SYBR ירוק מבוסס על צבע קושר DNA. | Taqman תלוי בבדיקות הכלאה ובפעילות אקסונוקלאז של 5' עד 3' של פולימראז של Taq. |
| בדיקות עם תווית פלורסנטית | |
| אין צורך בבדיקות עם תיוג פלואורסצנטי. | דרושים בדיקות עם תווית כפולה. |
| ניתוח גנים מרובה | |
| לא ניתן להשתמש בו עבור מטרות גנים מרובי-פלקס. | ניתן להשתמש בו עבור יעדי גנים מרובי-פלקסים. |
| עלות | |
| זה פחות יקר. | זה יותר יקר. |
| Specificity | |
| זה פחות ספציפי ונקשר עם כל DNA גדיל כפול | אלה מאוד ספציפיים מכיוון שבדיקות מזהות את מוצרי ההגברה הספציפיים. |
| אפקטיביות | |
| זה פחות יעיל. | זה יעיל ביותר. |
| Application | |
| זה משמש ב-PCR בזמן אמת, הדמיית ג'ל אגרוז, תיוג DNA וכו'. | זה משמש ב-PCR בזמן אמת, כימות של ביטוי גנים, זיהוי פולימורפיזמים גנטיים וכו'. |
סיכום – SYBR Green and Taqman
Taqman ו-SYBR green הן שתי שיטות המשמשות ב-PCR בזמן אמת (PCR כמותי). שתי השיטות מאפשרות כימות של מוצר ה-PCR ביעילות ומסתמכות על פליטת הקרינה. שיטת טקמן משתמשת בבדיקות עם תווית כפולה לזיהוי ה-DNA המצטבר בעוד ששיטת SYBR Green משתמשת בצבע ניאון. לשתי השיטות הללו יש גם יישומים שונים בביולוגיה מולקולרית.
