הבדל מפתח – AFLP לעומת RFLP
למחקרי DNA יש חשיבות עצומה בהבנה ובקביעת קשרים פילוגנטיים, אבחון מחלות גנטיות ומיפוי הגנום של האורגניזם. מספר טכניקות הקשורות לניתוח DNA משמשות גם לזיהוי של גן מסוים או רצף DNA במאגר של DNA לא ידוע. הם ידועים בתור סמנים מולקולריים. Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) ו-Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) הם שני סמנים (שיטות) מולקולריים כאלה שפותחו בביולוגיה מולקולרית כדי לזהות שונות גנטית בין אורגניזמים. שתי השיטות חשובות באותה מידה ויש להן יתרונות וחסרונות.ההבדל העיקרי בין AFLP ל-RFLP הוא ש-AFLP כרוכה בהגברת PCR סלקטיבית של ה-DNA המעוכל בעוד ש-RFLP אינו כרוך בהגברת PCR סלקטיבית של שברי ה-DNA.
מה זה AFLP?
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) הוא כלי חשוב בביולוגיה מולקולרית ונמצא בשימוש נרחב בניתוח וריאציות גנטיות. AFLP מבוססת על הגברה ספציפית של PCR של ה-DNA הגנומי המפוצל וזיהוי הפולימורפיזם על ידי אוטורדיוגרפים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל. AFLP תורם רבות לזיהוי הבדלים גנטיים בזנים או מינים קרובים של ממלכות שונות כולל צמחים, בעלי חיים, חיידקים ופטריות. AFLP יכול להתבצע עם כמויות קטנות של דגימות DNA לא ידועות. זה לא מצריך ידע קודם ברצף ותכנון של בדיקות.
צעדים של AFLP
- בידוד של DNA
- עיכול של ה-DNA עם אנדונוקלאזות הגבלה
- קישור של קטעי ה-DNA המוגבלים עם מתאמים
- הגברה סלקטיבית של הפרגמנטים עם אתרי הגבלה ספציפיים
- הפרדת מוצרי ה-PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל
- ויזואליזציה של מטריצת הג'ל באמצעות אוטורדיוגרפיה
AFLP היא שיטה רגישה יותר וניתנת לשחזור שבה ניתן להשתמש בפרופיל DNA של מספר טקסים כולל פטריות, חיידקים, צמחים ובעלי חיים ללא ידע מוקדם על רצפי DNA. זה עוזר בזיהוי הבדלים קלים בין פרטים באוכלוסיות בשל אופיו הרגיש ביותר. AFLP חשובה גם במיפוי גנום, מחקרים משפטיים, בדיקות הורים, גנוטיפ וכו'.
איור 01: AFLP
מה זה RFLP?
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs) היא טכניקה המשמשת לזיהוי הווריאציות הגנטיות ברצפי DNA הומולוגיים.זוהי השיטה הראשונה שפותחה לפרופיל DNA. לאורגניזמים יש טביעות אצבעות DNA או פרופילי DNA ייחודיים. RFLP משמש כלי חשוב לניתוח השונות בין פרופילי DNA של אורגניזמים תוך-ספציפיים או קרובים שכן לרצפים הומולוגיים יש אתרי הגבלה שונים (מיקומים) שהם ייחודיים לאורגניזם מסוים. כאשר DNA הומולוגי מתעכל עם אנדונוקליזות הגבלה ספציפיות, זה יביא לפרופילי DNA שונים שהם ייחודיים לכל פרט. לכן, העיקר בשיטה זו הוא זיהוי של שונות גנטית בין אורגניזמים על ידי הגבלת DNA הומולוגי עם אנזימי הגבלה ספציפיים וניתוח של פולימורפיזם של אורך הפרגמנט באמצעות אלקטרופורזה ג'ל וספיגה. דפוסי הסיכה ייחודיים לכל אורגניזם ומאפיינות את הגנוטיפים הספציפיים.
צעדי RFLP
- בידוד של כמות מספקת של DNA מדגימות
- פיצול של דגימות ה-DNA עם אנדונוקליזות הגבלה ספציפיות לרצף קצר
- הפרדת השברים שהתקבלו באורכים שונים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
- העברה של פרופיל הג'ל לממברנה באמצעות סימון דרום
-
הכלאה של הממברנה עם בדיקות מסומנות וניתוח הפולימורפיזם של אורך הפרגמנט בכל פרופיל
RFLP היא טכניקה חשובה מאוד באיתור תורשת מחלה ומציאת הסיכון להתרחשות המחלה בקרב בני משפחה. RFLP משמש לעתים קרובות גם במיפוי גנום, זיהוי פושעים בזיהוי פלילי, בדיקות אבהות וכו'. ל-RFLP יש מספר מגבלות גם כן. RFLP דורש ידע מוקדם של נתוני רצף כדי לתכנן בדיקות להכלאה. זה גם דורש בידוד של כמות מספקת של DNA מהדגימה לניתוח, דבר שקשה במחקרים משפטיים.
איור 01: מיפוי RRFLP
מה ההבדל בין AFLP ל-RFLP?
ALFP לעומת RFLP |
|
| AFLP כרוך בהגברת PCR סלקטיבית של ה-DNA המעוכל. | RFLP אינו כרוך ב-PCR אלא אם כן הוא PCR-RFLP. |
| ידע ברצף | |
| אין צורך בידע מוקדם ברצף. | דרוש ידע קודם ברצף לבדיקות RFLP מתוכננות. |
| Reliability | |
| זה יותר אמין. | זה פחות אמין בהשוואה ל-AFLP. |
| יעילות בזיהוי פולימורפיזם | |
| לזה יש יעילות גבוהה יותר בזיהוי פולימורפיזם מאשר RFLP. | זה פחות יעיל בהשוואה ל-AFLP. |
| עלות | |
| זה קצת יקר בהשוואה ל-RFLP. | זה פחות יקר בהשוואה ל-AFLP. |
| Applications | |
| AFLPs יושמו על מיפוי גנום, טביעת אצבע של DNA, מחקרי גיוון גנטי, בדיקות אבהות וזיהוי פלילי | ניתוח RFLP הוא כלי חשוב במיפוי גנום, לוקליזציה של גנים להפרעות גנטיות, קביעת סיכון למחלה ובדיקת אבהות. |
סיכום – AFLP לעומת RFLP
AFLP ו-RFLP הן שתי טכניקות המשמשות כסמנים גנטיים להערכת המגוון והערכת הקשרים הגנטיים בביולוגיה מולקולרית. AFLP משמשת כשיטה יעילה ורגישה לזיהוי פולימורפיזם גנטי בין אורגניזמים מאשר RFLP. עם זאת, למרות שלשתי השיטות הללו יש יעילות שונה בזיהוי וריאציות גנטיות, הן עדיין משמשות לטביעת אצבעות DNA ואבחון מחלות.
