הבדל מפתח – מיצוי DNA לעומת RNA
חקר ה-DNA וה-RNA הם היבטים חיוניים על מנת להבין את המושגים הבסיסיים של ביולוגיה מולקולרית, ביוטכנולוגיה וגנטיקה. מיצוי של דגימות DNA ו-RNA טהורות נחוצות על מנת לבצע הליכים ניסיוניים במהלך מחקרים אלה. ההבדל העיקרי בין מיצוי DNA ל-RNA הוא שתהליך מיצוי הדנ"א מטהר את הדנ"א ואילו מיצוי ה-RNA מטהר את ה-RNA. לתהליך מיצוי ה-DNA יש שלושה שלבים שונים: תמוגה של תאים וקטבוליזם של שומנים וחלבונים של הממברנה, התקבצות של קטבוליטים על ידי תמיסת מלח מרוכזת ומשקעים של DNA עם אתנול.הליך שלושת השלבים עשוי להיות מורכב משני שלבים אופציונליים. תהליך טיהור רנ"א מורכב מארבעה שלבים שונים: הוספת גואנידיום תיאוצינאט לתמוגגת תאים, דנטורציה של חלבון כולל ריבונוקלאזות, הפרדת RNA ע"י הוספת כלורופורם ופנול ושטיפת המשקע באמצעות אתנול.
מהו מיצוי DNA?
מיצוי DNA הוא תהליך פיסיקלי וכימי של זה המשמש לטיהור DNA מדגימה. מיצוי DNA הוא היבט חשוב בהקשר של ביולוגיה מולקולרית ומדעים משפטיים. התהליך מורכב משלושה שלבים בסיסיים. בתחילה, יש להשיג את התאים המעניינים. לאחר מכן, תמוגג התא מקל על מנת לשבור את קרום התא, אשר פותח את התא וחושף את הציטופלזמה יחד עם ה-DNA. ניתן להשתמש בחומרי פעילי שטח או בחומרי ניקוי אחרים כדי לרזות את השומנים מממברנת התא בעוד שהחלבונים הקיימים מפוצלים על ידי פרוטאזות. זהו שלב אופציונלי. ברגע שהתא עובר ליטוש, התקבצות של המולקולות המקוטלות מקל על ידי תמיסות מלח מרוכזות.אחריו צנטריפוגה של התמיסה שמפרידה את גושי הפסולת מה-DNA. בשלב זה, ה-DNA המובחן מעורבב עם הריאגנטים והמלחים המשמשים במהלך מחזור התא.
איור 01: מיצוי DNA
כדי לטהר אותו עוד יותר, ניתן להשתמש בשלבים הבאים. שיטה אחת היא משקעים אתנול, הכוללת ערבוב אתנול קר כקרח עם דגימת ה-DNA המופרדת. ה-DNA אינו מסיס באלכוהול ובכך מייצר גלולה עקב הצטברות מולקולות ה-DNA יחד. נתרן אצטט מתווסף בתהליך זה על מנת להגביר את מידת המשקעים על ידי הגברת החוזק היוני. בנוסף לתהליך משקעים אתנול, ניתן לגרום לכך גם תהליך מיצוי פנול-כלורופורם. בשיטה זו, הפנול גורם לדנטורציה של החלבונים הקיימים בדגימה.לאחר הצנטריפוגה, חלבונים דנטורטים יישארו בשלב האורגני בעוד מולקולות ה-DNA המעורבבות עם כלורופורם יהיו נוכחות בשלב המימי. כלורופורם יסיר את שאריות הפנול. לאחר השלמת המיצוי, ה-DNA נשמר מומס במאגר TE או במים טהורים במיוחד.
מהו מיצוי RNA?
טיהור RNA הוא תהליך שבו RNA מטוהר מדגימה ביולוגית. בשל נוכחות ריבונוקלאז בתאים וברקמות, תהליך זה מסובך. לאנזים Ribonuclease יש את היכולת לפרק RNA במהירות. הטבע הכימי של ribonucleases הוא יציב ביותר, וקשה לבטל אותם. נטרול הריבונוקלאזים הוא אופציה. מכיוון שהאנזים הזה נמצא בכל מקום בתאים וברקמות, פותחו טכניקות מיוחדות למיצוי RNA. מבין השיטות הרבות, השיטה הנפוצה היא מיצוי Guanidinium thiocynate-phenol-chloroform.
איור 02: מיצוי RNA
שיטת המיצוי של Guanidinium thiocynate-phenol-chloroform תלויה בצנטריפוגה ובהפרדת פאזות. התערובת שיש לצנטריפוגה מורכבת מהדגימה המימית ומתמיסה רוויה במים המורכבת מפנול וכלורופורם. לאחר הצנטריפוגה, התמיסה מורכבת מפאזה מימית עליונה ומפאזה אורגנית תחתונה בתנאי pH ניטרלי (pH 7-8). RNA קיים בשלב המימי. השלב האורגני מורכב בדרך כלל מחלבונים מומסים בפנול ושומנים מומסים בכלורופורם. מתווסף סוכן כאוטרופי (מולקולה שיש לה את היכולת לשבור את קשרי המימן בין מולקולות המים); זה ידוע בשם, guanidinium thiocyanate. לסוכן זה יש את היכולת לסנן חלבונים הכוללים ריבונוקלאזים שיכולים לפרק RNA ומעורב בתמוגת תאים. זה גם מפריד בין rRNA לחלבונים ריבוזומליים.השלב האחרון של טיהור RNA הוא שטיפת המשקעים של השלב המימי עם אתנול. ניתן גם לטהר RNA באמצעות חנקן נוזלי.
מהם הדמיון בין מיצוי DNA ו-RNA?
- שני תהליכי המיצוי משתמשים בכימיקלים מזיקים כמו פנול וכלורופורם.
- צנטריפוגה היא טכניקה חיונית לשני התהליכים.
- אתנול משמש לשטיפת המשקע ולהשגת DNA או RNA מטוהרים.
מה ההבדל בין מיצוי DNA ו-RNA?
מיצוי DNA לעומת RNA |
|
| מיצוי DNA הוא תהליך המחלץ DNA מאורגניזם או מדגימה. | מיצוי RNA הוא תהליך המחלץ RNA מדגימה. |
| צעדים | |
| תהליך מיצוי ה-DNA מורכב משלושה שלבים שונים עם שני שלבים אופציונליים. | תהליך מיצוי ה-RNA מורכב מארבעה שלבים שונים. |
| Reagents | |
| חומרי שטח, פרוטאזות (אופציונלי), אלכוהול, כלורופורם, פנול, נתרן אצטט משמשים למיצוי DNA. | Guanidium thiocyanate, כלורופורם, פנול, אתנול משמשים למיצוי RNA. |
סיכום – מיצוי DNA לעומת RNA
מיצוי DNA ו-RNA הם היבטים חיוניים בהליכים הניסויים לחקר ביולוגיה מולקולרית, גנטיקה וביוטכנולוגיה. שני התהליכים כוללים ריאגנטים דומים, אך מיצוי RNA משתמש במגיב מיוחד המכונה Guanidium thiocyanate אשר מפחית את הפעילות של ribonucleases.זה ההבדל העיקרי בין מיצוי DNA ו-RNA.
הורד גרסת PDF של מיצוי DNA לעומת RNA
ניתן להוריד את גרסת ה-PDF של מאמר זה ולהשתמש בה למטרות לא מקוונות לפי הערת ציטוט. אנא הורד כאן גרסת PDF ההבדל בין מיצוי DNA ו-RNA
