הבדל מפתח - נייר מול שכבה דקה לעומת כרומטוגרפיה של עמודות
כרומטוגרפיה של נייר, כרומטוגרפיה שכבה דקה וכרומטוגרפיה עמודה הם שלושה סוגים של טכניקות כרומטוגרפיות. ההבדל העיקרי בין כרומטוגרפיית נייר, כרומטוגרפיה שכבה דקה וכרומטוגרפיה עמודה מבוססים על סוג השלב הנייח המשמש בטכניקת הכרומטוגרפיה. כרומטוגרפיית נייר משתמשת בנייר תאית כשלב הנייח שלו, כרומטוגרפיה בשכבה דקה משתמשת באלומינה או סיליקה ג'ל כשלב הנייח שלה, ואילו כרומטוגרפיה עמודה משתמשת בעמודה עמוסה בחומר מטריצה מתאים כשלב נייח שלה.
בתהליך ההפרדה והזיהוי של ביומולקולות כגון חלבונים ופחמימות, כרומטוגרפיה היא טכניקה ביו-פיזיקלית חשובה המשמשת. כרומטוגרפיה מפרידה בין תרכובות על סמך מסיסותן, גודלן ומטענן. בהתבסס על מנגנון ההפרדה, הכרומטוגרפיה משתמשת במנגנונים כמו חילופי יונים, ספיגה, חלוקה והרחקת גודל וישנן שלוש טכניקות כרומטוגרפיות; כלומר, נייר, שכבה דקה וכרומטוגרפיה של עמודות. כרומטוגרפיה של נייר מבוססת על ספיחת מוצק-נוזל ומסיסות התרכובת, והיא משתמשת בנייר תאית כשלב נייח. כרומטוגרפיה של שכבה דקה מבוססת על ספיחת מוצק-נוזל של מולקולות. יש לו שלב נייח שעשוי בדרך כלל מאלומינה או סיליקה ג'ל והשלב הנייד שהוא הממס. כרומטוגרפיית עמודות משתמשת בעמודה עמוסה במטריצה המשמשת להפרדת מולקולות בעיקר על סמך גודלן, הזיקה או המטען שלה.
מהי כרומטוגרפיית נייר?
כרומטוגרפיה נייר היא הסוג הפשוט ביותר של כרומטוגרפיה בשימוש, והיא אינה משמשת למחקר מקיף. הוא משמש בעיקר במעבדות סטודנטים לזיהוי ביומולקולות כגון חומצות אמינו ופחמימות הקיימות בתערובות. כרומטוגרפיה של נייר משתמשת בפאזה נייחת הנוצרת באמצעות נייר תאית או נייר פילטר Whatman ובפאזה ניידת המוכנה בדרך כלל באמצעות ממיסים אורגניים כגון n-butanol וכו'. הפאזה הנייחת רוויה במים, מה שהופך את הפאזה הנייחת לנוזלית. כך, כאשר התרכובות מזוהות ומאפשרות לרוץ בנוכחות הפאזה הניידת, בהתאם למסיסות התרכובות, הן מופרדות. לפיכך, עם התפתחות הכרומטוגרמה, ניתן לבצע צביעה כדי לקבוע את הריצה לאורך כל תרכובת. על ידי כך ניתן לחשב את מקדם השמירה.
איור 01: כרומטוגרפיית נייר
ניתן לסווג עוד יותר את כרומטוגרפיית הנייר ככרומטוגרפיית נייר עולה וכרומטוגרפית נייר יורדת בהתאם לכיוון הממס הפועל.
מהי כרומטוגרפיה בשכבה דקה?
כרומטוגרפיה דקה או TLC היא טכניקה נפוצה לזיהוי חומצות אמינו שונות הקיימות בתערובת או לזיהוי חלבונים. טכניקת ההפרדה מבוססת על ספיחת מוצק-נוזל. במהלך כרומטוגרפיה של שכבה דקה, צלחת עשויה אלומינה או סיליקה ג'ל משמשת כשלב נייח. תערובת הממס משתנה בהתאם לדרישה ועשויה להשתמש בשילובים שונים של תרכובות אורגניות כגון n-butanol, חומצה אצטית ומים להכנת הממס. התרכובות שיש להפריד מנוקדות על הצלחת וטובלות בתערובת הממס. ברגע שהממס עולה על בסיס הפעולה הנימים שנותנת הצלחת, התרכובות המנומרות על הצלחת נעות גם הן בהתאם למסיסותן בממס.
איור 02: כרומטוגרפיית שכבה דקה
זיהוי הכתמים לאחר הכרומטוגרמה נעשה על ידי הליכי צביעה שונים. יש המשתמשים בצביעה נינהידרין שהיא שיטה רעילה למדי של צביעה. כרומטוגרמות שכבה דקות מודרניות משתמשות בטכניקות פלואורסצנטיות כדי לצפות בכרומטוגרמה לאחר הריצה. בהתאם למרחקים שהוא עבר, ניתן לחשב את זמן השמירה של כל מתחם. זה יכול לשמש כדי לזהות את סוג התרכובת המופרדת על סמך התערובת שבה נעשה שימוש. TLC משמש בעיקר לזיהוי חומצות אמינו בתערובת חלבונים וגם להפרדת סוגים שונים של חד-סוכרים הנמצאים בתערובת.
מהי כרומטוגרפיית עמודות?
עמודה כרומטוגרפיה היא מונח רחב המשמש לתיאור סוגים רבים של טכניקות כרומטוגרפיה המשתמשות בשיטת ההפרדה מבוססת העמודות.בכרומטוגרפיה עמודה משתמשים בעמודה פיזיקלית עם חומר אריזה להפרדת התרכובות. ההפרדה עשויה להתבסס על תכונות פיזיקליות שונות שמציגות התרכובות. מאפיינים אלה יכולים להיות המטען, הגודל, מבנה התלת-ממד ויכולת הקישור וכו'. לפיכך, העמוד העמוס בחומר המטריצה פועל כשלב נייח ומאגר הכביסה המופעל על העמוד פועל כשלב הנייד.
אם המולקולות מופרדות על סמך הגודל, חומר האריזה נארז באופן שהוא משאיר נקבוביות לתרכובות לעבור דרכן. לפיכך, המולקולות הגדולות יותר שאינן יכולות לזרום דרך הנקבוביות נפלטות תחילה, בעוד שלמולקולות הקטנות לוקח הרבה יותר זמן להיפלט.
איור 03: כרומטוגרפיית עמודות
אם המולקולות מופרדות על סמך המטען שלהן, השלב הנייח יכיל מחליף אניונים או קטונים שאליו התרכובות ימשכו על סמך המטען שלהן. לפיכך במהלך שלב הכביסה, התרכובות הלא קשורות ייפלטו. עם הוספת מאגר האלוציה, התרכובות הטעונות הקשורות ייפלטו. זיהוי החומרים הללו מבוסס בעיקר על טכניקות ספקטרופוטומטריות.
מהם הדמיון בין שכבת נייר דקה לכרומטוגרפיה של עמודות?
- כל נייר דק שכבה ועמודות כרומטוגרפיה משמשות שלוש טכניקות להפרדה של ביומולקולות כגון חומצות אמינו, חלבונים ופחמימות.
- לטכניקות כרומטוגרפיה בשכבה דקה של נייר ועמודות יש שלב נייד ושלב נייח.
- טכניקות כרומטוגרפיה בשכבה דקה של נייר ועמודות משתמשות במנגנונים ביו-פיזיקליים להפרדה.
מה ההבדל בין שכבת נייר דקה לכרומטוגרפיה של עמודות?
נייר מול שכבה דקה מול כרומטוגרפיה של עמודות |
|
| כרומטוגרפיית נייר | כרומטוגרפיית נייר היא טכניקה כרומטוגרפית המשמשת להפרדת תרכובות המבוססות על ספיחת נוזל-נוזל ומסיסות התרכובת. הוא משתמש בנייר תאית כשלב הנייח שלו. |
| Chromatography שכבה דקה | כרומטוגרפיה בשכבה דקה היא טכניקה כרומטוגרפית נוספת המבוססת על ספיחת מוצק-נוזל של מולקולות. יש לו שלב נייח עשוי אלומינה או סיליקה ג'ל וממס כפאזה ניידת, שהוא הממס. |
| כרומטוגרפיית עמודות | כרומטוגרפיה של עמודות משתמשת בעמודה עמוסה במטריצה המשמשת להפרדת מולקולות בעיקר על סמך גודלן, הזיקה או המטען שלהן. |
| שלב נייח | |
| כרומטוגרפיית נייר | נייר העשוי מניטרוצלולוזה של Whatman משמש כשלב נייח בכרומטוגרפיית נייר. |
| Chromatography שכבה דקה | אלומינה או ג'ל סיליקה משמשים כשלב נייח של כרומטוגרפיית השכבה הדקה. |
| כרומטוגרפיית עמודות | עמוד ארוז בחומר אריזה מתאים משמש כשלב נייח בכרומטוגרפיית העמודה. |
| שלב הנייד | |
| כרומטוגרפיית נייר | ממס פועל הוא השלב הנייד של כרומטוגרפיית הנייר. |
| Chromatography שכבה דקה | ממס פועל הוא השלב הנייד של כרומטוגרפיית השכבה הדקה. |
| כרומטוגרפיית עמודות | מאגר כביסה הוא השלב הנייד של כרומטוגרפיית העמודה. |
| מנגנונים המשמשים להפרדה | |
| כרומטוגרפיית נייר | כרומטוגרפיית נייר מבוססת על ספיגת מוצק-נוזל. |
| Chromatography שכבה דקה | כרומטוגרפיית שכבה דקה מבוססת על ספיגת מוצק-נוזל. |
| כרומטוגרפיית עמודות | כרומטוגרפיית עמודות מבוססת על אי הכללת גודל, טעינה וצורה. |
| Elution Buffer | |
| כרומטוגרפיית נייר | לא נדרש בכרומטוגרפיית נייר. |
| Chromatography שכבה דקה | לא נדרש עבור כרומטוגרפיית שכבה דקה. |
| כרומטוגרפיית עמודות | נדרש בכרומטוגרפיית עמודות. |
| Detection | |
| כרומטוגרפיית נייר | כתמה ועל ידי קביעת מקדם השמירה. |
| Chromatography שכבה דקה | כתמה ועל ידי קביעת מקדם השמירה. |
| כרומטוגרפיית עמודות | קביעה ספקטרופוטומטרית. |
סיכום – שכבת נייר דקה לעומת כרומטוגרפיה של עמודות
כרומטוגרפיה של נייר, TLC וכרומטוגרפיה של עמודות הן טכניקות הפרדה המשמשות להפרדת ביומולקולות כגון חלבונים, חומצות אמינו ופחמימות (בעיקר חד סוכרים).כרומטוגרפיית נייר משתמשת בנייר תאית כשלב נייח, ומנגנון ההפרדה מבוסס על ספיחה של מוצק-נוזל. TLC משתמשת גם במנגנוני ספיחה של מוצק-נוזל. המולקולות מופרדות על השלב הנייח, בהתאם למסיסותן בשלב הנייד. כרומטוגרפיה של עמודות משתמשת בתכונות פיזיקליות כגון גודל, צורה, מטען ומשקל המולקולרי של התרכובת כדי להפריד. העמודה העמוסה בחומר המטריצה פועלת כשלב נייח, ואילו חיץ הכביסה משמש כשלב הממס. זה ההבדל בין שכבת נייר דקה לכרומטוגרפיה עמודה.
