ההבדל העיקרי בין גולדן גייט ל-Gibson Assembly הוא ש-Golden Gate מסתמך על נוכחותם של אתרי הגבלה בתוך רצף מסוים שיש לשבט, בעוד ש-Gibson Assembly אינו מסתמך על נוכחותם של אתרי הגבלה בתוך רצף מסוים. להיות משובט.
במהלך העשורים האחרונים, מדענים מולקולריים פיתחו נהלים סטנדרטיים שונים המאפשרים הרכבה קלה יותר של שברי DNA מרובים ליצירה אחת. לכן, שיטות שיבוט כגון Restriction Enzyme Ligation, Gateway Cloning, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly ו-TOPO Cloning נמצאות בשימוש נרחב על ידי חוקרים בניסויים מדעיים.לכן, Golden Gate ו-Gibson Assembly הן שתי שיטות שיבוט מולקולריות המאפשרות הרכבה של מספר רב של שברי DNA למקשה אחת.
מה זה Golden Gate Assembly?
Golden Gate היא שיטת שיבוט מולקולרית המאפשרת הרכבה של מספר רב של שברי DNA למקשה אחת. שיטה זו מסתמכת על נוכחות של אתרי הגבלה בתוך רצף מסוים שיש לשבט. מקורו בשנת 1996. טכניקה זו משתמשת באנזימי הגבלה מסוג IIS ובליגאז T4 DNA. אנזימים אלה חותכים DNA מחוץ לאתרי הזיהוי. הם יכולים ליצור תליה לא פלינדרוםית. לכן, ניתן להרכיב קטעים מרובים של DNA באמצעות שילובים של רצפי תליה.
איור 01: שער הזהב
נוהל הרכבה של שער הזהב
טכניקת שער הזהב כוללת שלושה שלבים עיקריים בהליך שלה:
- יצירת נקודות על בוקטור השיבוט,
- הרכבה של מספר תוספות DNA על ידי שימוש ברצפים ספציפיים לפרגמנטים בתולים, ו
- ligation.
הרכבת שער הזהב משתמשת בוקטורי שיבוט מעגליים (וקטור יעד). יתרה מזאת, בשיטה זו, אתר ההגבלה מסולק מהמוצר הקשור על מנת לבצע עיכול וקשירה בו זמנית. פרוטוקול מחזור תרמי טיפוסי עבור Golden Gate נע בין 37 מעלות צלזיוס ל-16 מעלות צלזיוס מכיוון ש-37 מעלות צלזיוס אופטימלית עבור אנזימי הגבלה ו-16 מעלות צלזיוס אופטימלית עבור ליגזות.
מה זה גיבסון אסמבלי?
Gibson Assembly היא שיטת שיבוט מולקולרית המאפשרת הרכבה של מספר רב של שברי DNA למקשה אחת. בניגוד לשיטת שער הזהב, שיטה זו אינה מסתמכת על נוכחות של אתרי הגבלה בתוך רצף מסוים שיש לשבט.הוא נמצא על ידי דניאל ג'י גיבסון ממכון ג'יי קרייג ונטר. טכניקה זו היא סוג של שיטת שיבוט בלתי תלוי ברצף וליגאז (SLIC).
איור 02: אסיפת גיבסון
נוהל ההרכבה של גיבסון
Gibson Assembly זקוק לשברי DNA המכילים 20-40 זוגות בסיסים החופפים לשברי DNA סמוכים. חפיפות מתווספות באמצעות PCR. לאחר מכן מוסיפים את שברי ה-DNA הללו לתערובת ה-Gibson Maser שיש בה שלושה אנזימים. הליך זה מתבצע בתנאים איזותרמיים (50 מעלות צלזיוס למשך שעה) תוך שימוש בשלושה אנזימים שונים: אקסונוקלאז, DNA פולימראז ו-DNA ligase. האקסונוקלאז לועס את ה-DNA מקצה 5'. לפיכך, הוא אינו מעכב את פעילות הפולימראז ומאפשר לתגובה להתקדם בתהליך אחד.האזורים החד-גדיליים המתקבלים על שברי DNA סמוכים יכולים להיות חישול עקב רצפי חפיפה. DNA פולימראז ממלא את הפערים על ידי הוספת נוקלאוטידים. לבסוף, ליגאז ה-DNA מצטרף באופן קוולנטי ל-DNA של מקטעים סמוכים. בדרך כלל, גיבסון אסמבלי משתמש בוקטורי יעד ליניאריים. יתרה מכך, שיטה זו יכולה לשלב בו-זמנית עד 15 שברי DNA בהתבסס על דמיון ברצף.
דמיון בין שער הזהב לאסיפת גיבסון
- Golden Gate ו-Gibson Assembly הן שתי שיטות שיבוט מולקולרי.
- שתי השיטות יכולות להרכיב קטעי DNA מרובים לחתיכה אחת.
- שיטות אלה משתמשות בוקטורי יעד.
- שתי השיטות משתמשות במחזורים תרמיים להרכבה של שברי DNA מרובים.
- הם משמשים למוטגנזה מכוונת אתרים.
ההבדל בין שער הזהב ל-Gibson Assembly
Golden Gate היא שיטת שיבוט מולקולרית המשמשת בהרכבה של קטעי DNA מרובים לחתיכה אחת המסתמכת על נוכחותם של אתרי הגבלה בתוך רצף מסוים שיש לשבט, בעוד ש-Gibson Assembly היא שיטת שיבוט מולקולרית המשמשת ב- הרכבה של מספר רב של שברי DNA לחתיכה אחת מבלי להסתמך על נוכחותם של אתרי הגבלה בתוך רצף מסוים שיש לשבט.זה ההבדל העיקרי בין שער הזהב לאסיפת גיבסון. יתר על כן, שיטת Golden Gate משתמשת בוקטור יעד מעגלי, בעוד ששיטת גיבסון Assembly משתמשת בוקטור יעדים ליניארי.
האינפוגרפיקה הבאה מציגה את ההבדל בין שער הזהב ל-Gibson Assembly.
סיכום – שער הזהב נגד גיבסון אסמבלי
שיבוט מולקולרי היא שיטה המשמשת להרכבת מולקולות DNA רקומביננטיות ולכוון את שכפולן בתוך אורגניזמים מארח. Golden Gate ו-Gibson Assembly הן שתי שיטות שיבוט מולקולריות המאפשרות הרכבה של מספר רב של שברי DNA למקשה אחת. שיטת הגולדן גייט מסתמכת על נוכחות של אתרי הגבלה בתוך רצף מסוים שיש לשבט, בעוד ש-Gibson Assembly לא מסתמך על נוכחות של אתרי הגבלה בתוך רצף מסוים שיש לשבט. לפיכך, זה ההבדל העיקרי בין שער הזהב ל-Gibson Assembly.
