הבדל מפתח – כתמים צפוניים מול דרום מול מערביים
זיהוי של רצפים ספציפיים של DNA, RNA וחלבונים חיוני לסוגים שונים של מחקרים בביולוגיה מולקולרית. אלקטרופורזה של ג'ל היא טכניקה המפרידה בין DNA, RNA וחלבונים לפי גודלם. מפרופילי הג'ל, רצף DNA מסוים, רצף RNA או חלבון מזוהים על ידי הטכניקות המיוחדות הנקראות סופג והכלאה עם בדיקות מסומנות. ישנם שלושה סוגים שונים של שיטות סיכה, כלומר דרומי, צפוני ומערבי. ההבדל העיקרי בין סיכה צפונית למערבית טמון בסוג המולקולה שהיא מזהה מדגימה. Southern blotting היא שיטה המזהה רצף DNA ספציפי מדגימת DNA. Northern blotting היא טכניקה המזהה רצף RNA ספציפי מדגימת RNA. Western blotting היא שיטה שמזהה חלבון ספציפי מדגימת חלבון.
מה זה סימון דרום?
טכניקת ה-Southern blotting פותחה על ידי E. M. Southern בשנת 1975 לצורך זיהוי רצף DNA ספציפי מדגימת DNA. זוהי טכניקת הספיגה הראשונה שהוצגה בביולוגיה מולקולרית. זה איפשר זיהוי של גנים ספציפיים מה-DNA, מקטעים ספציפיים מה-DNA וכו'. ישנם מספר שלבים המעורבים בטכניקת ה-Southern blotting. הם כדלקמן.
- DNA מבודד מהדגימה ומתעכל עם אנדונוקליזות הגבלה.
- דגימה מעוכלת מופרדת על ידי אלקטרופורזה של ג'ל Agarose.
- שברי DNA בג'ל עוברים דנטורציה לגדילים בודדים על ידי שימוש בתמיסה בסיסית.
- DNA חד-גדילי מועבר לממברנת סינון ניטרוצלולוזה על ידי העברה נימית.
- DNA מועבר מקובע על הממברנה לצמיתות.
- DNA קבוע על הממברנה עובר הכלאה עם בדיקות מסווגות.
- DNA לא קשור נשטף מהממברנה על ידי שטיפה.
- סרט רנטגן נחשף לממברנה ומוכן אוטורדיוגרף.
סימון דרום מיושם עבור היבטים שונים של ביולוגיה מולקולרית. זה שימושי במיפוי RFLP, מחקרים משפטיים, מתילציה של DNA בביטוי גנים, זיהוי גנים שעברו מוטציה בהפרעות גנטיות, טביעת אצבע של DNA וכו'.
איור 01: טכניקת סיכה דרומית
מה זה Northern Blotting?
Northern blotting היא שיטה שנועדה לזהות רצף RNA ספציפי או רצף mRNA מדגימה כדי לחקור את ביטוי הגנים. טכניקה זו פותחה על ידי Alwine, Kemp, and Stark בשנת 1979. היא שונה מטכניקות הספיגה הדרומית והמערבית בשל מספר שלבים. עם זאת, טכניקה זו מבוצעת גם באמצעות אלקטרופורזה ג'ל, ספיגה והכלאה עם בדיקות מסוימות וזיהוי ספציפיים. טכניקת ה-Northern blotting מתבצעת באופן הבא.
- RNA מופק מהדגימה ומופרד באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.
- RNA מועבר מהג'ל אל קרום סופג ומתקבע.
- הממברנה מטופלת עם בדיקה מסומנת שהוכנה מ-cDNA או RNA (הבדיקה משלימה לרצף ספציפי בדגימה).
- הבדיקה מודגרת עם הממברנה כדי להיקשר ברצף ספציפי.
- בדיקות לא קשורות נשטפות.
- שברים הכלאיים מזוהים באמצעות אוטורדיוגרף.
Northern blotting הוא כלי חשוב בזיהוי וכימות של mRNA הכלאי, חקר פירוק RNA, הערכת זמן מחצית חיים של RNA, זיהוי שחבור RNA, חקר ביטוי גנים וכו'.
איור 02: Northern Blotting
מה זה סומן ווסטרן?
Western blotting היא שיטה לזיהוי חלבון ספציפי מתערובת חלבון על ידי שימוש בנוגדנים מסומנים. לכן, כתם מערבי ידוע גם בשם אימונובלוט. טכניקה זו הוצגה על ידי Towbin et al בשנת 1979 וכיום היא מבוצעת באופן שגרתי במעבדות לניתוח חלבון. השלבים הם כדלקמן.
- חלבונים מופקים מהמדגם
- חלבונים מופרדים לפי הגדלים שלהם באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד
- מולקולות מופרדות מועברות לממברנת PVDF או לממברנת ניטרוצלולוזה באמצעות אלקטרופורציה
- הממברנה חסומה לקישור לא ספציפי עם הנוגדנים
- חלבונים מועברים קשורים לנוגדן ראשוני (נוגדנים המסומנים באנזים).
- הממברנה נשטפת כדי להסיר נוגדנים ראשוניים הקשורים לא ספציפית
- נוגדנים קשורים מתגלים על ידי הוספת מצע וזיהוי המשקע הצבעוני שנוצר
-Western blotting שימושי בזיהוי נוגדנים נגד HIV בדגימת סרום אנושית. כתם ווסטרן יכול לשמש גם כבדיקת אישור לזיהום בהפטיטיס B וכבדיקה סופית למחלת הפרה המשוגעת.
איור 03: Western Blotting
מה ההבדל בין כתמים צפוניים ומערביים?
כתמים צפוניים מול דרום מול מערביים |
|
| סוג מולקולה זוהה | |
| Northern Blotting | Northern blotting מזהה רצף RNA ספציפי מדגימת RNA. |
| Southern Blotting | Southern blotting מזהה רצף DNA ספציפי מדגימת DNA. |
| Western Blotting | -Western blotting מזהה חלבון ספציפי מדגימת חלבון. |
| סוג ג'ל | |
| Northern Blotting | זה משתמש בג'ל אגרוז/פורמלדהיד. |
| Southern Blotting | זה משתמש בג'ל Agarose. |
| Western Blotting | זה משתמש בג'ל פוליאקרילאמיד. |
| שיטת מחיקה | |
| Northern Blotting | זוהי העברה קפילרית. |
| Southern Blotting | זוהי העברה קפילרית. |
| Western Blotting | זוהי העברה חשמלית. |
| בדיקות בשימוש | |
| Northern Blotting | בדיקות cDNA או RNA שסומנו באופן רדיואקטיבי או לא רדיואקטיבי. |
| Southern Blotting | בדיקות DNA מסומנות באופן רדיואקטיבי או לא רדיואקטיבי. |
| Western Blotting | נוגדנים ראשוניים משמשים כבדיקות. |
| מערכת זיהוי | |
| Northern Blotting | זה נעשה באמצעות אוטורדיוגרף, או זיהוי של שינוי אור או צבע. |
| Southern Blotting | זה נעשה באמצעות אוטורדיוגרף, זיהוי של אור או שינוי צבע. |
| Western Blotting | זה נעשה באמצעות זיהוי של שינוי אור או צבע. |
סיכום – כתמים צפוניים מול דרום מול מערביים
Blotting היא טכניקה מיוחדת שפותחה לזיהוי של DNA, RNA או חלבון ספציפיים מהדגימות.ישנם שלושה הליכי סיכה נפרדים, כלומר צפוני, דרומי ומערבי, כדי לזהות סוג מסוים של מולקולה. טכניקת ה-Northern blotting נועדה לזהות רצף RNA ספציפי מתערובת של RNA. טכניקת ה-Southern blotting מאפשרת זיהוי של רצף DNA ספציפי מדגימת DNA וטכניקת סיכה מערבית פותחה כדי לזהות חלבון ספציפי מתערובת חלבון.
