הבדל מפתח - PCR לעומת רצף DNA
PCR ורצף DNA הן שתי טכניקות חשובות בביולוגיה מולקולרית. תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא התהליך היוצר מספר רב של עותקים של שבר DNA. רצף DNA הוא הטכניקה שמביאה לסדר המדויק של הנוקלאוטידים של קטע DNA נתון. זהו ההבדל העיקרי בין PCR ורצף DNA. PCR הוא אחד השלבים העיקריים המעורבים בריצוף DNA.
מה זה PCR?
תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא טכניקת הגברה של DNA המשמשת בביולוגיה מולקולרית. הוא מייצר אלפי עד מיליוני עותקים של שבר DNA מסוים.שיטה זו פותחה על ידי Kary Mullis בשנת 1983. בטכניקה זו, קטע ה-DNA המיועד להגברה משמש כתבנית ואנזים DNA פולימראז מוסיף נוקלאוטידים משלימים לפריימר הזמין בתערובת ה-PCR. בסוף תגובת ה-PCR, עותקים רבים של ה-DNA המדגם מסונתזים.
ישנם רכיבים שונים של תערובת ה-PCR, לרבות DNA, DNA פולימראז (Taq polymerase), פריימרים (פריימרים קדימה ואחורה), נוקלאוטידים (אבני בניין של DNA) ומאגר. PCR מתרחש בתוך מכונת PCR, ויש לטעון את תערובת ה-PCR הנכונה למכונה, ולהפעיל את התוכנית הנכונה. טכניקה זו מאפשרת ייצור של אלפי עד מיליוני עותקים של קטע מסוים של DNA מכמות קטנה מאוד של DNA.
תגובות PCR מתרחשות בצורה מחזורית כדי לייצר את הכמות הנראית לעין של מוצרי PCR על ג'ל. ישנם שלושה שלבים עיקריים המעורבים בתגובת PCR כלומר דנטורציה, חישול פריימר והארכת גדיל כפי שמוצג באיור 01.שלושת השלבים הללו מתרחשים בשלוש טמפרטורות שונות. DNA קיים בצורה כפולה על ידי קשרי מימן בין הבסיסים המשלימים. לפני ההשלכה, יש להפריד DNA גדילי כפול זה מזה. זה נעשה על ידי מתן טמפרטורה גבוהה. בטמפרטורה גבוהה, דנטור גדילי כפול לגדילים בודדים. אז הפריימרים צריכים להתקרב לקצוות האגפים של הפרגמנט הספציפי או לגן של ה-DNA. פריימר הוא חתיכה קצרה של DNA חד-גדילי המשלימה לרצף המטרה. פריימרים קדימה ואחורה מתערפלים עם הבסיסים המשלימים בקצוות האגפים של ה-DNA המדגים הדנטורטי בטמפרטורת החישול. פריימרים צריכים להיות עמידים בחום. ברגע שהפריימרים מתערפלים עם ה-DNA המדגם, אנזים taq polymerase מתחיל את הסינתזה של הגדילים החדשים על ידי הוספת נוקלאוטידים המשלימים ל-DNA היעד. Taq פולימראז הוא אנזים יציב בחום המבודד מחיידק תרמופיל בשם Thermus aquaticus. מאגר PCR שומר על התנאים האופטימליים לפעולת ה-taq פולימראז.שלושת השלבים הללו של תגובות PCR חוזרים על עצמם כדי לייצר את הכמות הנדרשת של תוצר PCR. לאחר כל תגובת PCR, מספר עותק ה-DNA מוכפל. לפיכך, ניתן לראות הגברה אקספוננציאלית ב-PCR. ניתן לצפות במוצרי PCR באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל וניתן לטהר אותם למחקרים נוספים.
איור 01: השלבים העיקריים של תגובת PCR
PCR הוא כלי רב ערך במחקר רפואי וביולוגי. ל-PCR יש ערך מיוחד במדע המשפטי מכיוון שהוא יכול להגביר DNA למחקרים מהדגימות הזעירות מהפושעים וליצור פרופילי DNA פורנזיים. PCR נמצא בשימוש נרחב בתחומים רבים של ביולוגיה מולקולרית כולל, גנוטיפ, שיבוט גנים, זיהוי מוטציות, רצף DNA, מיקרו-מערכי DNA ובדיקות אבהות וכו'.
איור 02: תגובת שרשרת פולימראז
מהו רצף DNA?
ריצוף DNA הוא קביעת סדר מדויק של הנוקלאוטידים - אדנין, גואנין, ציטוזין ותימין במקטע DNA נתון. מידע גנטי מאוחסן ברצפי ה-DNA תוך שימוש בסדר הנכון של הנוקלאוטידים. לפיכך, מציאת הסדר המדויק של הנוקלאוטידים במקטע DNA חשוב מאוד לדעת על המבנה והתפקוד של הגנים.
פרוטוקול רצף DNA כולל תהליכים שונים. הצעד הראשון הוא בידוד של DNA מתעניין או DNA גנומי של אורגניזם. באמצעות PCR (כמתואר לעיל), יש להגביר את האזור הרצוי של ה-DNA. מוצר PCR מוגבר צריך להיות מופרד על ידי אלקטרופורזה ג'ל ולטהר. קטעים מוגברים משמשים כתבניות לרצף.ניתן לבצע רצף בעקבות רצף Sanger או שיטת רצף תפוקה גבוהה. רצף סנגר דורש אלקטרופורזה נימית של שברי DNA שנוצרו. קביעת סדר הנוקלאוטידים הנכון יכולה להיעשות על ידי קריאה ידנית של אוטורדיוגרפים או באמצעות רצפי DNA אוטומטיים.
ריצוף גנים תרם לפרויקט הגנום האנושי והקל על מיפוי הגנום האנושי בשנת 2003. בזיהוי פלילי, ריצוף DNA איפשר זיהוי של פרטים המציגים רצפי DNA ייחודיים ומזהים את הפושעים. ברפואה ניתן להשתמש ברצף DNA כדי לזהות את הגנים האחראים למחלות גנטיות ואחרות, למצוא גנים פגומים ולהחליפם בגנים נכונים. בחקלאות, מידע על רצף DNA של כמה מיקרואורגניזמים משמש לייצור יבולים מהונדסים בעלי מאפיינים רצויים מבחינה כלכלית.
איור 03: רצף DNA
מה ההבדל בין PCR לרצף DNA?
PCR לעומת DNA רצף |
|
| תהליך PCR יוצר אלפי עד מיליוני עותקים של קטע ה-DNA המעוניין. | ריצוף DNA הוא התהליך של קביעת הסדר המדויק של הנוקלאוטידים במקטע DNA נתון. |
| תוצאה | |
| PCR יוצר אלפי עד מיליוני עותקים של קטע DNA מסוים | זה מביא לסדר הנכון של הבסיסים בקטע DNA מסוים. |
| מעורבות של ddNTPs | |
| PCR אינו דורש ddNTPs. הוא משתמש ב-dNTPs. | ריצוף DNA דורש ddNTPs כדי לסיים את היווצרות גדיל. |
סיכום – PCR לעומת DNA רצף
PCR ורצף DNA הם כלים חשובים מאוד בתחומים רבים של הביולוגיה המולקולרית. הגברה של שברי ה-DNA מתבצעת בטכניקת PCR בעוד שהסדר הנכון של הנוקלאוטידים של שבר DNA נקבע על ידי רצף ה-DNA. זה ההבדל בין PCR ורצף DNA.
