הבדל מפתח - Nick Translation vs Primer Extension
תרגום ניק והרחבת פריימר הן שתי טכניקות חשובות המבוצעות בביולוגיה מולקולרית. ההבדל העיקרי בין תרגום ניק להארכת פריימר הוא שתהליך תרגום ניק מייצר בדיקות מסומנות לטכניקות הכלאה אחרות בעוד ששיטת הרחבת פריימר מזהה רצף RNA ספציפי מתערובת וחושפת מידע על הביטוי של mRNA. לשתי הטכניקות יש חשיבות רבה והן מבוצעות באופן שגרתי במעבדות מחקר מולקולרי.
מהו תרגום ניק?
תרגום ניק הוא טכניקה חשובה המשמשת להכנת בדיקות מתויגות לטכניקות ביולוגיות מולקולריות שונות כגון סתימות, הכלאה באתרו, הכלאה פלואורסצנטית באתר וכו'.זוהי שיטה חוץ גופית לתיוג DNA. בדיקות DNA משמשות לזיהוי רצפי DNA או RNA ספציפיים. בעזרת בדיקה מסומנת, ניתן לסמן או להמחיש פרגמנטים ספציפיים מתערובת מורכבת של חומצת גרעין. לכן, בדיקות מסומנות מוכנות באמצעות טכניקות שונות לשימוש בטכניקות שונות. תרגום ניק היא שיטה כזו שמייצרת בדיקות מסומנות בעזרת אנזימים DNase 1 ו-DNA פולימראז 1.
תהליך תרגום הניק מתחיל בפעילות האנזים DNase 1. DNase 1 מציג חריצים בעמוד השדרה הפוספטי של DNA גדילי כפול על ידי ביקוע קשרי פוספודיאסטר בין נוקלאוטידים. לאחר יצירת הניק תיווצר קבוצת OH 3' חופשית של הנוקלאוטיד ואנזים DNA פולימראז 1 יפעל עליה. פעילות אקסונוקלאז 5' עד 3' של DNA פולימראז 1 מסירה נוקלאוטידים מהחץ לכיוון 3' של גדיל ה-DNA. במקביל, פעילות הפולימראז של אנזים DNA פולימראז 1 פועלת ומוסיפה נוקלאוטידים כדי להחליף את הנוקלאוטידים שהוסרו.אם הנוקלאוטידים סומנו, ההחלפה תתרחש על ידי הנוקלאוטידים המסומנים והיא תסמן את ה-DNA לזיהוי. ניתן להשתמש ב-DNA המסומן החדש הזה כבדיקות בתגובות הכלאה שונות בביולוגיה מולקולרית.
איור 01: תהליך התרגום של Nick
מה זה הרחבת פריימר?
הרחבת פריימר היא טכניקה המשמשת למציאת רצף RNA ספציפי מתערובת RNA ולאיתור קצה 5' של תמליל ה-mRNA. הוא משמש גם לחקר מבנה ה-RNA והביטוי. שיטת הארכת פריימר מתבצעת עם פריימרים מסומנים או עם נוקלאוטידים מסומנים. אם משתמשים בפריימרים מסומנים, זה לא כולל את הצורך לסמן את הנוקלאוטידים המשמשים לסינתזה של cDNA.ישנם מספר שלבים בטכניקה זו. זה מתחיל עם מיצוי של RNA מהדגימה. לאחר מכן מתווסף פריימר אוליגונוקלאוטידים לתערובת יחד עם המרכיבים הדרושים לסנתז cDNA של רצף RNA ספציפי. פריימר מחשל עם הרצף המשלים מהתערובת. באמצעות רצף ה-primer annealed כתבנית, האנזים reverse transcriptase מסנתז את ה-DNA המשלים (cDNA) של רצף ה-RNA. חישול פריימר ותעתוק הפוך מתרחשים רק כאשר רצף ה-RNA הספציפי קיים בדגימה. לבסוף, כאשר מבוצעת אלקטרופורזה של ג'ל דנטורציה, ניתן לקבוע את גודל רצף ה-RNA. קל גם למצוא את בסיס 1+ של רצף ה-mRNA (אתר תחילת שעתוק) על ידי שיטת הארכת הפריימר. ניתן לכמת את כמות ה-mRNA הקיימת בדגימה בשיטה זו אם משתמשים בעודף פריימר.
איור 02: סיומת פריימר
מה ההבדל בין Nick Translation ל-Primer Extension?
Nick Translation vs Primer Extension |
|
| תרגום ניק הוא תהליך שיוצר בדיקות DNA מסומנות לתגובות הכלאה שונות. | הרחבת פריימר היא טכניקה המשמשת לאיתור RNA ספציפי או לחקר ביטוי גנים. |
| אנזימים בשימוש | |
| נעשה שימוש באנזימי DNase 1 ו-DNA פולימראז. | נעשה שימוש באנזים טרנסקריפטאז הפוך. |
| חשיבות | |
| תרגום ניק מקל על סימון רצף DNA ספציפי. | הרחבת פריימר מאפשרת זיהוי של גודל רצף mRNA ספציפי והכמות הקיימת בדגימה. |
סיכום – Nick Translation vs Primer Extension
תרגום ניק היא שיטה המשמשת לסינתזה של בדיקות מסומנות על בסיס הפעילויות של אנזימים DNase 1 ו-E coli DNA פולימראז 1. זוהי שיטה חוץ גופית המופעלת במעבדות לפני טכניקות הכלאה שונות. במהלך תרגום הניק, פעילות אקסונוקלאז 5'-3' של DNA פולימראז 1 מסירה נוקלאוטידים לפני הניק ופעילות פולימראז של DNA פולימראז 1 מחליפה את הנוקלאוטידים שהוסרו בנוקלאוטידים מסומנים מאחורי הניק. הרחבת פריימר היא שיטה המשמשת לאיתור תמליל RNA ספציפי מתערובת ולכמת את הגודל והכמות של RNA העניין. זה ההבדל בין תרגום ניק לבין סיומת פריימר.
