הבדל מפתח - Ligation Blunt vs Sticky End
Endonucleases של הגבלה הם אנזימים ספציפיים החותכים DNA דו-גדילי (dsDNA). הם ידועים גם כמספריים מולקולריים בביולוגיה מולקולרית. אנזימי הגבלה מסוגלים לזהות רצפים קצרים ספציפיים של ה-dsDNA הידועים כאתרי זיהוי ולבקע קשרי פוספודיאסטר ומימן כדי לפתוח גדילים כפולים. כתוצאה מביקוע על ידי אנזימים אלה, מיוצרים שברי DNA עם סוגים שונים של קצוות כגון קצוות דביקים וקצוות קהים. DNA ליגאז הוא אנזים המשמש בביולוגיה מולקולרית כדי לחבר שני גדילים סמוכים של DNA על ידי יצירת קשרים חדשים.השלב ידוע כקשירה ובהתאם לסוג קצה ה-DNA המקושר, ניתן להתייחס אליהם כקשירת קצה קהה וקשירת קצה דביק. ההבדל העיקרי בין קשירת קצה קהה לדביקה הוא שקשירת קצה קהה מתרחשת בין שברי DNA המכילים שני קצוות קהים ואילו קשירת קצה דביק מתרחשת בין נקודות על של 5' ו-3'. בהשוואה לקשירת קצה קהה, קשירת קצה דביק יעילה ויציבה יותר.
מה זה קשירת קצה בוטה?
כמה אנדונוקליזות הגבלה יכולות לחתוך את ה-DNA בבסיסים ההפוכים ולייצר שברי DNA קהים. אנזימים אלה ידועים כחותכי קצה קהה; הם מתפצלים ישר לאמצע אתר ההגבלה מבלי להשאיר בסיסים תלויים תקועים בודדים. קצוות קהים ידועים גם כקצוות שאינם תלויים, מכיוון שאין להם בסיסים תלויים בגובה 3' ו-5' בקצוות. שני הגדילים מסתיימים מזוגות בסיסים בקצוות קהים. אנזימים נפוצים לחיתוך קצה קהה הם EcoRV HaeIII, AluI ו-SmaI.
קשירת קצה קהה מעורבת בין שני קצוות קהים. זה לא קשירה של בסיסים בולטים. קשירה זו פחות יעילה מקשירת קצה דביק. עם זאת, במקרים מסוימים, קשירת קצה קהה הופכת ליתרון יותר מקשירת קצה דביק, במיוחד בעת קשירת מוצרי PCR. מוצרי PCR מיוצרים תמיד עם קצוות קהים. קשירת קצה קהה אינה דורשת קצוות משלימים ב-DNA עבור הקשירה.
איור 01: ייצור קצה בוטה על ידי אנזים Eco RV
מה זה קשירת קצה דביק?
כמה אנדונוקלאסים של הגבלה מסוגלים לחתוך dsDNA, ומשאירים בקצה חתיכה תלויה של DNA חד-גדילי. קצוות אלה ידועים כקצוות דביקים או תלויים. קשירת קצוות דביקה מתרחשת בין שני שברי DNA המכילים סתימות תואמות מכיוון שלקצוות דביקים יש בסיסים לא מזווגים ודורשים בסיסים משלימים כדי ליצור קשרים.לפיכך, יש צורך להשתמש באותו אנזים הגבלה עבור שני מקורות ה-DNA כדי לייצר את קטעי הקשירה התואמים.
קשירת קצה דביק יעילה יותר ולרוב רצוי מאוד בתהליכי שיבוט. ישנם מספר אנזימי הגבלה המייצרים קצוות דביקים. הם EcoRI, BamHI, HindIII וכו'.
איור 02: ייצור קצה דביק על ידי אנזים Eco RI
מה ההבדל בין Ligation Blunt ו-Sticky End?
Blunt vs Sticky End Ligation |
|
| קשירת קצה קהה מתרחשת בין שני שברי DNA עם קצה קהה. | קשירת קצה דביק מתרחשת בין שני שברי DNA תואמים עם קצוות דביקים. |
| אנזימים | |
| חותכי קצוות קהים מייצרים קצוות קהים. | חותכי קצוות דביקים מייצרים קצוות דביקים או מגובשים. |
| דרישת קצוות תואמים | |
| זה לא דורש קטעים תואמים או בסיסים משלימים. | זה דורש בסיסים משלימים בקצוות כדי ליצור זוגות בסיסים. |
| יעילות | |
| זה פחות יעיל מקשירת קצה דביק | זה יעיל יותר מקשירת קצה קהה. |
סיכום – Ligation Blunt vs Sticky End
Endonucleases של Restriction מסוגלים לבקע dsDNA ולייצר שברי DNA עם קצוות שונים.הם מזהים רצפים ספציפיים ומגבילים DNA ויוצרים קצוות דביקים וחטים. לקצוות הדביקים יש בסיסים לא מזווגים בקצה השברים. קצוות קהים נוצרים עקב מחשוף ישר ויש להם זוגות בסיסים בקצוות. קשירת קצה דביק דורשת שני חלקי DNA חד-גדילי משלימים. קשירת קצה קהה מתרחשת בין כל שני שברי קצה קהה. זה ההבדל בין קשירה קהה לדביקה.
